En integrert arbeidsflyt for å studere promotor-sentriske romlig-temporale genomarkitektur i knappe cellepopulasjoner

Summary

Genuttrykk reguleres av interaksjoner av genpromotorer med distale regulatoriske elementer. Her beskriver vi hvor lav inngang Capture Hi-C (liCHi-C) tillater identifisering av disse interaksjonene i sjeldne celletyper, som tidligere ikke var målbare.

Abstract

Spatiotemporal gentranskripsjon er tett regulert av distale regulatoriske elementer, for eksempel forsterkere og lyddempere, som er avhengige av fysisk nærhet med målgenpromotorene for å kontrollere transkripsjon. Selv om disse regulatoriske elementene er enkle å identifisere, er deres målgener vanskelige å forutsi, siden de fleste av dem er celletypespesifikke og kan skilles av hundrevis av kilobaser i den lineære genomsekvensen, og hopper over andre ikke-målgener. I flere år har Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) vært gullstandarden for assosiasjon av distale regulatoriske elementer til deres målgener. Imidlertid er PCHi-C avhengig av tilgjengeligheten av millioner av celler, og forbyr studiet av sjeldne cellepopulasjoner som de som vanligvis oppnås fra primære vev. For å overvinne denne begrensningen har lav inngang Capture Hi-C (liCHi-C), en kostnadseffektiv og tilpassbar metode for å identifisere repertoaret av distale regulatoriske elementer som styrer hvert gen i genomet, blitt utviklet. liCHi-C er avhengig av et lignende eksperimentelt og beregningsorientert rammeverk som PCHi-C, men ved å bruke minimale rørendringer, modifisere reagenskonsentrasjonen og volumene, og bytte eller eliminere trinn, står det for minimalt materialtap under bibliotekkonstruksjon. Samlet muliggjør liCHi-C studiet av genregulering og spatiotemporal genomorganisasjon i sammenheng med utviklingsbiologi og cellulær funksjon.

Introduction

Temporal genuttrykk driver celledifferensiering og til slutt organismeutvikling, og endringen er nært knyttet til en bred mengde sykdommer 1,2,3,4,5. Gentranskripsjon er fint regulert av virkningen av regulatoriske elementer, som kan klassifiseres som proksimale (dvs. genpromotorer) og distale (f.eks. Forsterkere eller lyddempere), hvorav sistnevnte ofte ligger langt fra deres målgener og fysisk interagerer med dem gjennom kromatinsløyfing for å modulere genuttrykk ^6,7,8.

Identifiseringen av distale regulatoriske regioner i genomet er et spørsmål som det er bred enighet om, siden disse regionene har spesifikke histonmodifikasjoner 9,10,11 og inneholder spesifikke transkripsjonsfaktorgjenkjenningsmotiver, som fungerer som rekrutteringsplattformer for dem^12,13,14. Dessuten, når det gjelder forsterkere og superforsterkere 15,16, har de også lavt nukleosombelegg 17,18 og transkriberes til ikke-kodende eRNA ^19,20.

Ikke desto mindre er hvert distale regulatoriske elements målgener vanskeligere å forutsi. Oftere enn ikke er interaksjoner mellom distale regulatoriske elementer og deres mål celletype og stimulusspesifikke 21,22, spenner over hundrevis av kilobaser, bygger bro over andre gener i hvilken som helst retning 23,24,25, og kan til og med lokaliseres inne i introniske regioner av deres målgen eller andre ikke-intervenerende gener ^26,27. Videre kan distale regulatoriske elementer også kontrollere mer enn ett gen samtidig, og omvendt^28,29. Denne posisjonelle kompleksiteten hindrer å finne regulatoriske assosiasjoner mellom dem, og derfor forblir de fleste av hvert regulatoriske elements mål i hver celletype ukjente.

I løpet av de siste årene har det vært en betydelig boom i utviklingen av kromosomkonformasjonsfangst (3C) teknikker for å studere kromatininteraksjoner. Den mest brukte av dem, Hi-C, gjør det mulig å generere et kart over alle interaksjonene mellom hvert fragment av en celles genom³⁰. For å oppdage betydelige interaksjoner på restriksjonsfragmentnivået, er Hi-C imidlertid avhengig av ultradyp sekvensering, og forbyr bruken av den til rutinemessig å studere det regulatoriske landskapet til individuelle gener. For å overvinne denne økonomiske begrensningen har flere anrikningsbaserte 3C-teknikker dukket opp, for eksempel ChIA-PET³¹, HiChIP 32 og dens motstykke HiCuT³³ med lav inngang. Disse teknikkene er avhengige av bruk av antistoffer for å berike for genom-brede interaksjoner mediert av et spesifikt protein. Ikke desto mindre er den unike egenskapen til disse 3C-teknikkene også bane for deres anvendelse; Brukere regner med tilgjengeligheten av antistoffer av høy kvalitet for proteinet av interesse og kan ikke sammenligne forhold der bindingen av proteinet er dynamisk.

Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) er en annen anrikningsbasert 3C-teknikk som omgår disse begrensningene^34,35. Ved å bruke et biotinylert RNA-proberikelsessystem, er PCHi-C i stand til å generere genombrede høyoppløselige biblioteker av genomiske regioner som interagerer med 28 650 human- eller 27 595 musekommenterte genpromotorer, også kjent som promotorinteraktomet. Denne tilnærmingen gjør det mulig å oppdage signifikante langdistanseinteraksjoner ved restriksjonsfragmentnivåoppløsningen til både aktive og inaktive promotorer, og robust sammenligne promotorinteraktomer mellom enhver tilstand uavhengig av dynamikken til histonmodifikasjoner eller proteinbinding. PCHi-C har blitt mye brukt de siste årene for å identifisere promotorinteraktomreorganiseringer under celledifferensiering 36,37, identifisere virkningsmekanismen til transkripsjonsfaktorer^38,39, og oppdage nye potensielle gener og veier deregulert i sykdom av ikke-kodende varianter 40,41,42,43,44,45^,46,47,48, sammen med nye driver-ikke-kodende mutasjoner^49,50. Dessuten, ved bare å modifisere fangstsystemet, kan denne teknikken tilpasses i henhold til det biologiske spørsmålet for å forhøre ethvert interaktom (f.eks. forsterkerinteraktomet 51 eller interaktomet til en samling ikke-kodende endringer^41,52).

Imidlertid er PCHi-C avhengig av minst 20 millioner celler for å utføre teknikken, noe som forhindrer studiet av knappe cellepopulasjoner som de som ofte brukes i utviklingsbiologi og kliniske applikasjoner. Av denne grunn har vi utviklet lav inngang Capture Hi-C (liCHi-C), en ny kostnadseffektiv og tilpassbar metode basert på det eksperimentelle rammeverket til PCHi-C for å generere høyoppløselige promotorinteraktomer med lavcelleinngang. Ved å utføre eksperimentet med minimale rørendringer, bytte eller eliminere trinn fra den opprinnelige PCHi-C-protokollen, drastisk redusere reaksjonsvolumer og modifisere reagenskonsentrasjoner, maksimeres bibliotekets kompleksitet og det er mulig å generere biblioteker av høy kvalitet med så lite som 50 000 celler⁵³.

Low input Capture Hi-C (liCHi-C) har blitt benchmarked mot PCHi-C og brukt til å belyse promotorinteraktomomkobling under human hematopoietisk celledifferensiering, oppdage potensielle nye sykdomsassosierte gener og veier deregulert av ikke-kodende endringer, og oppdage kromosomale abnormiteter⁵³. Den trinnvise protokollen og de forskjellige kvalitetskontrollene gjennom teknikken er detaljert her til den endelige generasjonen av bibliotekene og deres beregningsanalyse.

Protocol

For å sikre minimalt materialtap, (1) arbeid med DNA lavbindende rør og spisser (se materialfortegnelse), (2) plasser reagenser på rørveggen i stedet for å introdusere spissen inne i prøven, og (3) bland om mulig prøven ved inversjon i stedet for å pipetere prøven opp og ned, og spinn ned etterpå for å gjenopprette prøven. 1. Cell fiksering Celler som vokser i suspensjonHøst 50 000 til en million celler og plasser dem i et DNA la…

Representative Results

liCHi-C tilbyr muligheten til å generere høykvalitets og oppløsning genombrede promotor-interaktombiblioteker med så lite som 50.000 celler53. Dette oppnås ved – i tillegg til den drastiske reduksjonen av reaksjonsvolumer og bruk av DNA lavbindende plastikk gjennom hele protokollen – å fjerne unødvendige trinn fra den opprinnelige protokollen, der betydelige materielle tap oppstår. Disse inkluderer fenolrensing etter decrosslinking, fjerning av biotin og påfølgende fenol-kloroformrensing…

Discussion

liCHi-C tilbyr muligheten til å generere høyoppløselige promotor-interaktombiblioteker ved hjelp av et lignende eksperimentelt rammeverk fra PCHi-C, men med et sterkt redusert cellenummer. Dette oppnås i stor grad ved å eliminere unødvendige trinn, for eksempel fenolrensing og fjerning av biotin. I den klassiske in-nucleus ligation Hi-C protokoll⁵⁷ og dens påfølgende derivatteknikk PCHi-C, fjernes biotin fra ikke-ligerte restriksjonsfragmenter for å unngå å trekke ned DNA-fragmenter som…

Materials

0.4 mM Biotin-14-dATP	Invitrogen	19524-016
0.5 M EDTA pH 8.0	Invitrogen	AM9260G
1 M Tris pH 8.0	Invitrogen	AM9855G
10x NEBuffer 2	New England Biolabs	B7002S	Referenced as restriction buffer 2 in the manuscript
10x PBS	Fisher Scientific	BP3994
10x T4 DNA ligase reaction buffer	New England Biolabs	B0202S
16% formaldehyde solution (w/v), methanol-free	Thermo Scientific	28908
20 mg/mL Bovine Serum Albumin	New England Biolabs	B9000S
5 M NaCl	Invitrogen	AM9760G
5PRIME Phase Lock Gel Light tubes	Qiuantabio	2302820	For phenol-chloroform purification in section 4 (DNA purification). Phase Lock Gel tubes are a commercial type of tubes specially designed to maximize DNA recovery after phenol-chloroform purifications while avoiding carryover of contaminants in the organic phase by containing a resin of intermediate density which settles between the organic and aqueous phase and isolates them. PLG tubes should be spun at 12,000 x g for 30 s before use to ensure that the resin is well-placed at the bottom of the tube
Adapters and PCR primers for library amplification	Integrated DNA Technologies	–	Bought as individual primers with PAGE purification for NGS
Cell scrappers	Nunc	179693	Or any other brand
Centrifuge (fixed-angle rotor for 1.5 mL tubes)	Any brand
CHiCAGO R package	1.14.0
CleanNGS beads	CleanNA	CNGS-0050
dATP, dCTP, dGTP, dTTP	Promega	U120A, U121A, U122A, U123A	Or any other brand
DNA LoBind tube, 1.5 mL	Eppendorf	30108051
DNA LoBind tube, 2 mL	Eppendorf	30108078
DNA polymerase I large (Klenow) fragment 5000 units/mL	New England Biolabs	M0210L
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 beads	Invitrogen	65002	For biotin pull-down of the pre-captured library in section 8 (biotin pull-down)
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 beads	Invitrogen	65602	For biotin pull-down of the post-captured library in section 11 (biotin pull-down and PCR amplification)
DynaMag-2	Invitrogen	12321D	Or any other magnet suitable for 1.5 ml tubeL
Ethanol absolute	VWR	20821.321
FBS, qualified	Gibco	10270-106	Or any other brand
Glycine	Fisher BioReagents	BP381-1
GlycoBlue Coprecipitant	Invitrogen	AM9515	Used for DNA coprecipitation in section 4 (DNA purification)
HiCUP	0.8.2
HindIII, 100 U/µL	New England Biolabs	R0104T
IGEPAL CA-630	Sigma-Aldrich	I8896-50ML
Klenow EXO- 5000 units/mL	New England Biolabs	M0212L
Low-retention filter tips (10 µL, 20 µL, 200 µL and 1000 µL)	ZeroTip	PMT233010, PMT252020, PMT231200, PMT252000
M220 Focused-ultrasonicator	Covaris	500295
Micro TUBE AFA Fiber Pre-slit snap cap 6 x 16 mm vials	Covaris	520045	For sonication in section 6 (sonication)
NheI-HF, 100 U/µL	New England Biolabs	R3131M
Nuclease-free molecular biology grade water	Sigma-Aldrich	W4502
PCR primers for quality controls	Integrated DNA Technologies	–
PCR strips and caps	Agilent Technologies	410022, 401425
Phenol: Chloroform: Isoamyl Alcohol 25:24:1, Saturated with 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA	Sigma-Aldrich	P3803
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer	New England Biolabs	M0531L	For amplification of the library in sections 9 (dATP-tailing, adapter ligation and PCR amplification) and 11 (biotin pull-down and PCR amplification)
Protease inhibitor cocktail (EDTA-free)	Roche	11873580001
Proteinase K, recombinant, PCR grade	Roche	3115836001
Qubit 1x dsDNA High Sensitivity kit	Invitrogen	Q33230	For DNA quantification after precipitation in section 4 (DNA purification)
Qubit assay tubes	Invitrogen	Q32856
rCutsmart buffer	New England Biolabs	B6004S
RPMI Medium 1640 1x + GlutaMAX	Gibco	61870-010	Or any other brand
SDS – Solution 10% for molecular biology	PanReac AppliChem	A0676
Sodium acetate pH 5.2	Sigma-Aldrich	S7899-100ML
SureSelect custom 3-5.9 Mb library	Agilent Technologies	5190-4831	Custom designed mouse or human capture system, used for the capture
SureSelect Target Enrichment Box 1	Agilent Technologies	5190-8645	Used for the capture
SureSelect Target Enrichment Kit ILM PE Full Adapter	Agilent Technologies	931107	Used for the capture
T4 DNA ligase 1 U/µL	Invitrogen	15224025	For ligation in section 3 (ligation and decrosslink)
T4 DNA ligase 2000000/mL	New England Biolabs	M0202T	For ligation in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation and PCR amplification)
T4 DNA polymerase 3000 units/mL	New England Biolabs	M0203L
T4 PNK 10000 units/mL	New England Biolabs	M0201L
Tapestation 4200 instrument	Agilent Technologies		For automated electrophoresis in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation, and PCR amplification) and section 11 (Biotin pull-down and PCR amplification). Any other automated electrophoresis system is valid
Tapestation reagents	Agilent Technologies	5067-5582, 5067-5583, 5067-5584, 5067-5585,	For automated electrophoresis in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation, and PCR amplification) and section 11 (Biotin pull-down and PCR amplification). Any other automated electrophoresis system is valid
Triton X-100 for molecular biology	PanReac AppliChem	A4975
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416-50ML