Integrerad fotoakustisk, ultraljud och angiografisk tomografi (PAUSAT) för icke-invasiv helhjärnavbildning av ischemisk stroke

Summary

Detta arbete demonstrerar användningen av en multimodal ultraljudsbaserad bildplattform för icke-invasiv avbildning av ischemisk stroke. Detta system möjliggör kvantifiering av blodets syresättning genom fotoakustisk avbildning och nedsatt perfusion i hjärnan genom akustisk angiografi.

Abstract

Här presenteras en experimentell ischemisk strokestudie med vårt nyutvecklade icke-invasiva bildsystem som integrerar tre akustikbaserade bildtekniker: fotoakustisk, ultraljud och angiografisk tomografi (PAUSAT). Att kombinera dessa tre modaliteter hjälper till att förvärva multispektral fotoakustisk tomografi (PAT) av hjärnans blodsyresättning, högfrekvent ultraljudsavbildning av hjärnvävnaden och akustisk angiografi av cerebral blodperfusion. Den multimodala avbildningsplattformen möjliggör studier av cerebral perfusion och syresättningsförändringar i hela mushjärnan efter stroke. Två vanliga ischemiska strokemodeller utvärderades: den permanenta mellersta cerebrala artärocklusionsmodellen (pMCAO) och den fototrombotiska (PT) modellen. PAUSAT användes för att avbilda samma mushjärnor före och efter en stroke och kvantitativt analysera båda strokemodellerna. Detta bildsystem kunde tydligt visa hjärnans vaskulära förändringar efter ischemisk stroke, inklusive signifikant minskad blodperfusion och syresättning i strokeinfarktregionen (ipsilateral) jämfört med den oskadade vävnaden (kontralateral). Resultaten bekräftades av både laserspeckle kontrastavbildning och trifenyltetrazoliumklorid (TTC) färgning. Dessutom mättes och validerades strokeinfarktvolymen i båda slagmodellerna genom TTC-färgning som grundsanning. Genom denna studie har vi visat att PAUSAT kan vara ett kraftfullt verktyg i icke-invasiva och longitudinella prekliniska studier av ischemisk stroke.

Introduction

Blod transporterar syre (via hemoglobinproteinet) och andra viktiga näringsämnen till vävnader i våra kroppar. När blodflödet genom vävnader avbryts (ischemi) kan allvarliga skador på vävnaderna uppstå, vars mest omedelbara effekter beror på brist på syre (hypoxi). Ischemisk stroke är resultatet av avbrutet blodflöde till en viss region i hjärnan. Hjärnskador till följd av en ischemisk stroke kan inträffa inom några minuter efter en kärlblockering och kan ofta ha försvagande och varaktiga effekter ^1,2. En mycket värdefull strategi för att utvärdera fysiopatologin efter ischemisk stroke och identifiera och testa nya behandlingar är användningen av smådjursmodeller i labbet. Behandlingar som upptäcks i labbet syftar till att översättas till klinisk användning och förbättra patienternas liv. Användningen av djur i biomedicinsk forskning måste dock utvärderas noggrant enligt Russell och Burchs 3R-principer: ersättning, minskning och förfining³. Syftet med reduktionskomponenten är att minska antalet djur utan att äventyra datainsamlingen. Med detta i åtanke möjliggör möjligheten att longitudinellt utvärdera lesionsutvecklingen via icke-invasiv avbildning en stor fördel för att minska antalet djur som krävs, samt maximera informationen som erhållits från varje djur⁴.

Fotoakustisk tomografi (PAT) är en hybrid bildmodalitet som kombinerar optisk absorptionskontrast med ultraljudsavbildning rumslig upplösning⁵. Bildmekanismen för PAT är som följer. En excitationslaserpuls tänds på målet som avbildas. Förutsatt att målet absorberar ljus vid excitationslaserns våglängd, kommer det att öka i temperatur. Denna snabba temperaturökning resulterar i en termoelastisk expansion av målet. Expansionen får en ultraljudsvåg att sprida sig ut från målet. Genom att detektera ultraljudsvågen vid många positioner kan den tid som krävs för vågen att sprida sig från målet till detektorerna användas för att skapa en bild genom en rekonstruktionsalgoritm. PAT: s förmåga att detektera optisk absorption i djupa vävnadsregioner skiljer PAT från ultraljudsavbildning, som detekterar gränser för olika akustiska impedanser hos vävnader⁵. I de synliga och nära infraröda spektra är de primära högabsorberande biomolekylerna som är rikliga i organismer hemoglobin, lipider, melanin och vatten⁷. Av särskilt intresse för studien av stroke är hemoglobin. Eftersom oxyhemoglobin och deoxihemoglobin har olika optiska absorptionsspektra kan PAT användas med flera excitationslaservåglängder för att bestämma den relativa koncentrationen av proteinets två tillstånd. Detta gör att syremättnaden av hemoglobin (_sO2) eller syresättning i blodet kan kvantifieras i och utanför infarktregionen ^8,9. Detta är en viktig åtgärd vid ischemisk stroke, eftersom det kan indikera syrehalten i den skadade hjärnvävnaden efter ischemi.

Akustisk angiografi (AA) är en kontrastförstärkt ultraljudsavbildningsmetod som är särskilt användbar för att avbilda morfologin hos vaskulatur in vivo¹⁰. Metoden bygger på användning av en wobblergivare med dubbla element (ett lågfrekvent element och ett högfrekvent element) i kombination med mikrobubblor som injiceras i bildämnets cirkulationssystem. Givarens lågfrekventa element används för sändning vid mikrobubblornas resonansfrekvens (t.ex. 2 MHz), medan högfrekvenselementet används för att ta emot mikrobubblornas superharmoniska signaler (t.ex. 26 MHz). När de exciteras vid en resonansfrekvens har mikrobubblorna ett starkt olinjärt svar, vilket resulterar i produktion av superharmoniska signaler som omgivande kroppsvävnader inte producerar¹¹. Genom att ta emot med ett högfrekvent element säkerställer detta att endast mikrobubbelsignalerna detekteras. Eftersom mikrobubblorna är begränsade till blodkärlen är resultatet en angiografisk bild av blodkärlsmorfologi. AA är en kraftfull metod för att avbilda ischemisk stroke, eftersom mikrobubblorna som strömmar genom cirkulationssystemet inte kan strömma genom blockerade kärl. Detta gör det möjligt för AA att upptäcka regioner i hjärnan som inte perfuseras på grund av ischemisk stroke, vilket indikerar infarktregionen.

Preklinisk ischemisk strokeforskning bygger i allmänhet på användningen av histologi och beteendetestning för att bedöma platsen och svårighetsgraden av stroke. Trifenyltetrazoliumklorid (TTC) färgning är en vanlig histologisk analys som används för att bestämma strokeinfarktvolymen. Det kan dock endast användas vid en slutpunkt, eftersom det kräver att djuret avlivas¹². Beteendetester kan användas för att bestämma nedsatt motorfunktion vid flera tidpunkter, men de kan inte ge kvantitativa anatomiska eller fysiologiska värden¹³. Biomedicinsk avbildning ger ett mer kvantitativt tillvägagångssätt för att studera effekterna av ischemisk stroke icke-invasivt och longitudinellt 9,14,15. Befintliga avbildningstekniker (t.ex. magnetisk resonanstomografi av små djur [MRT]) kan dock komma till en hög kostnad, inte kunna tillhandahålla samtidig strukturell och funktionell information eller ha begränsat penetrationsdjup (som de flesta optiska avbildningstekniker).

Här kombinerar vi fotoakustisk, ultraljud och angiografisk tomografi (PAUSAT; se systemdiagram i figur 1), vilket möjliggör kompletterande strukturell och funktionell information om blodperfusion och syresättning efter ischemisk stroke¹⁶. Dessa är två viktiga aspekter vid bedömning av skadans svårighetsgrad och övervakning av återhämtning eller svar på behandlingar. Med hjälp av dessa integrerade avbildningsmetoder kan öka mängden information som erhålls av varje djur, minska antalet djur som krävs och ge mer information i studien av potentiella behandlingar för ischemisk stroke.

Figur 1: PAUSAT-diagram. (A) Fullständig schematisk bild av PAUSAT-systemet, inklusive laser och OPO som används för PAT. (B) Inifrån av PAUSAT-systemet, inklusive två ultraljudsgivare. Wobbler-givaren med dubbla element används för både B-mode ultraljud och AA, och den linjära matrisgivaren används för PAT. Båda givarna är monterade på samma 2D-motoriserade steg, vilket möjliggör skanning för att generera volymetriska data. Denna siffra har ändrats från¹⁶. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Protocol

Alla djurförsök godkändes av Duke University Medical Center Animal Care and Use Committee och genomfördes i enlighet med United States Public Health Service’s Policy on Humane Care and Use of Laboratory Animals. Möss av hane och hona C57BL/6J (se materialtabell) användes för dessa studier. Minst tre djur avbildades per strokemodellgrupp. Se bild 2 för arbetsflödet som följs i det här protokollet. <p class="jove_content biglegend" fo:keep-together.within-page="…

Representative Results

Avbildning av blodkärlsmorfologi i hjärnanAA genererar blodkärlsmorfologiska bilder genom spännande mikrobubblor i cirkulationssystemet vid deras resonansfrekvens och tar emot mikrobubblornas superharmoniska respons. Genom att använda den anpassade rampen (figur 2C) fäst vid ett manuellt justerbart steg kan vi avbilda mushjärnan med AA-läge på två olika brännvidder. När djupare regioner riktas visar mer ytliga regioner (som hjärnbarken) en sämre upplösning…

Discussion

Det finns några viktiga aspekter av denna metod som, om de görs felaktigt, kan leda till avsevärt minskad bildkvalitet och kvantitativ analys. Det vanligaste resultatet av användarfel i PANAT-bilder är antingen brist på signal eller mycket låg signalstyrka, som båda kan uppstå av olika skäl. En sådan anledning är ett problem med den akustiska kopplingen. Stora luftbubblor i vattnet som omger musens huvud under avbildning kan ofta blockera ultraljudet från att resa till eller från givaren, vilket orsakar ett…

Materials

20 GA catheter	BD Insyte Autoguard Winged	381534	For mouse intubation
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride	Sigma	T8877	Necessary for TTC-staining brain for validation
532nm Laser	Quantel	Q-smart 850	Laser used to pump the OPO for PAT
Automatic Ventilator Rovent Jr.	Kent Scientific	RV-JR	To keep mice under anesthesia during surgical procedure
Black braided silk 4-0 USP	Surgical Specialties	SP116	Used for sutures on the neck for pMCAO surgery
Bupivacaine	Hospira	0409-1159-18	Used prior to closing wounds during surgical procedure
C57BL/6 Mice	Jackson Lab	#000664	Mice used for studying ischemic stroke (2-6 month old male/female)
Clear suture	Ethicon	8606	Used for closing wound (PT stroke and pMCAO). A clear suture won't interfere with PAT
Cold Light LED	Schott	KL 1600	Needed to create PT stroke
Disposable Razor Blade	Accutec Blades	74-0002	For sectioning mouse brain
Electric drill	JSDA	JD-700	Used to expose MCA during pMCAO procedure
Electrocauterization tool	Wet-Field	Wet-Field Bipolar-RG	Stops blood flow after drilling during pMCAO procedure
Hair removal gel	Veet	8282651	Used to remove hair from mouse prior to imaging
High Temperature Cautery Loop Tip	BOVIE Medical Corporation	REF AA03	Used to avoid bleeding when separating the temporal muscle from the skull
IR Detector Card	Thorlabs	VRC5	Used to ensure light path is aligned
Laser Power Meter	Ophir	StarBright, P/N 7Z01580	Can be used to calibrate the laser energy prior to imaging
Laser Speckle Imaging System	RWD Life Science Co.	RFLSI-III	Can be used to validate stroke surgery success
Lubricant Eye Ointment	Soothe	AB31336	Can be used to avoid drying of the eyes
Manually adjustable stage	Thorlabs	L490	Used with custom ramp for multiple focal depth AA imaging
Modified Vega Imaging System	Perkin Elmer	LLA00061	System containing both B-mode/AA and PAT transducers
Optical Parametric Oscillator	Quantel	versaScan-L532	Allows for tuning of excitation wavelength in a large range
Programmable Ultrasound System	Verasonics	Vantage 256	Used for PAT part of system
Rose Bengal	Sigma	330000	Necessary to induce PT stroke
Suture	LOOK	SP116	Used for permanent ligation of CCA
Temperature Contoller	Physitemp	TCAT-2	Used to maintain stable body temperature of mice during procedures
VesselVue Microbubbles	Perkin Elmer	P-4007001	Used for acoustic angiography (2.43 × 10^9 microbubbles/mL)