Et trekanals dual-reporter fluorescensflowanalysesystem blev brugt til at udvikle et perlebaseret multipleximmunoassay, der samtidig evaluerer serumprøver for IgG og IgM fremkaldt mod flere antigener af forskellige Borrelia-arter , der forårsager borreliose i Europa og Nordamerika.
For at overvåge udviklingen af infektionssygdomme er det nyttigt at vurdere immunoreaktivitet mod forskellige antigene determinanter og måle forskellige antistofisotyper, fordi de forekommer på forskellige stadier af værtsimmunresponset. Med Lyme borreliose kan det patogene middel være et af de mange medlemmer af Borrelia-arten . Derfor kræver korrekt prøveklassificering evaluering af immunreaktiviteten mod forskellige antigener af forskellige Borrelia-arter . Derudover kan antipatogene IgG- og IgM-reaktioner have forskellige udløsningstidsforløb under sygdomsprogression. Her demonstrerer vi udviklingen af et to-reporter multiplex immunoassay, der har nytte til at identificere Borrelia-specifikt immunrespons i humane serumprøver ved samtidig at evaluere både IgG og IgM immunreaktivitet mod forskellige bakterielle antigener i samme reaktionsbrønd. Denne tilgang med to indberetninger bevarer den analytiske ydeevne af enkeltindberettermetoder, samtidig med at der spares tid og ressourcer, og kravene til stikprøvestørrelse reduceres. Denne analyse gør det muligt i det væsentlige at fordoble den serologiske information, der skal genereres fra en blodprøve på den halve tid.
Lyme borreliosis er den mest almindelige krydsbårne infektionssygdom i moderate klimaer på den nordlige halvkugle1. Det er forårsaget af spirochete bakterier af slægten Borrelia, med fem kendte humane patogener, der varierer i geografisk fordeling2. De vigtigste patogene Borrelia-arter i Europa er B. afzelii og B. garinii, med B. burgdorferi s.s., B. spielmanii og B. bavariensis mindre hyppigt. I Nordamerika er B. burgdorferi s.s. det eneste årsagsmiddel til Lyme borreliosis 2,3. Borrelia-patogener overføres af medlemmer af flåtslægten Ixodes, med transmission, der kan forekomme inden for 24 timer efter flåtbid4.
Lyme borreliose diagnose er typisk lavet af kliniske symptomer og efterfølgende bekræftet af serologi. I både Europa og Nordamerika anbefaler diagnostiske retningslinjer en totrinstestserie bestående af et enzymbundet immunosorbentassay (ELISA) med en refleksimmunoblot til evaluering af antistofrespons mod Borrelia-specifikke antigener 1,5,6,7,8,9 . Denne fremgangsmåde mangler imidlertid følsomhed og er ikke optimal, især i den tidlige fase af infektionen, hvor serokonversion kan være ufuldstændig og anti-Borrelia IgG- og IgM-titere er for lave6.
Multipleximmunoassays forbedrer traditionelle immunoassays, der kun måler et mål ad gangen, og kan samtidig evaluere flere antistofisotyperesponser mod et eller flere antigener 10,11,12. Assays såsom ELISA’er er begrænset til at identificere og kvantificere en enkelt analysand pr. reaktion, i det foreliggende tilfælde enten cirkulerende IgG eller IgM induceret mod et enkelt bakterielt antigen efter infektion med Borrelia. Denne rapport illustrerer brugen af perlebaseret analytprofileringsteknologi til udvikling af et multipleximmunoassay, der samtidig detekterer både IgG- og IgM-antistoffer mod ethvert af de heri valgte Borrelia-antigener i humane serumprøver. Vi udvalgte fire antigener, der tilsammen dækker de mest almindelige patogene Borrelia-arter, der er hjemmehørende i Europa (B. garinii, B. afzelii, B. burgdorferi s.s.) og Nordamerika (B. burgdorferi s.s.) (Tabel 1) 2,3. Dette muliggør afgørende patogenidentifikation og evnen til at skelne tidlig IgM og senere, mere holdbar, IgG-immunreaktivitet i patientprøver.
Mål isotype | Reporter Kanal | Antigen | Borrelia arter | Stamme | Koncentration af antigenkobling |
Igm | PE | OspC | B. Garinii | 20047 | 5,0 μg/106 perler |
IgG | BV421 | VlsE | B. burgdorferi s.s | B31 | 1,25 μg/106 perler |
IgG | BV421 | DbpA | B. burgdorferi s.s. | ZS7 | 10,0 μg/106 perler |
IgG | BV421 | DbpA | B. Afzelii | PKo | 5,0 μg/106 perler |
Tabel 1: Repræsentative Borrelia-antigener anvendt til udvikling af multiplexassay.
Vi udviklede oprindeligt et enkeltreporterimmunoassay, der detekterede enten anti-Borrelia-antigen IgG- eller IgM-antistoffer i to separate reaktioner og fusionerede derefter disse assays til et dual-reporter-multiplexassay, der måler begge antistofisotyper i den samme reaktionsblanding. Magnetiske perler kobles til et patogenmålantigen af interesse og inkuberes derefter med patientserumprøver. Det perlekoblede antigen genkendes af og fanger både cirkulerende IgG og IgM i serum, der genereres i et immunrespons mod det patogenantigen. Assay IgG versus IgM-specificitet bestemmes ved udvælgelsen af et sekundært antistof, der binder til enten IgG eller IgM, hver med et særskilt fluoroforsignal forbundet med de to sekundære antistoffer. Hvert fluorescerende signal detekteres i en af instrumentets to Reporterkanaler (dvs. dobbeltreporter), der har en anden excitationslaser og emissionsoptagelse, der er specifik for den enkelte fluorofor, der bruges til at detektere enten IgG eller IgM (her henholdsvis Brilliant Violet 421 eller phycoerythrin). Instrumentklassifikationskanalen identificerer det farvekodede farvestof, der er iboende for forskellige perlesæt. Således kan flere målantigener kobles til forskelligt farvede perler, og perlesættene blandes sammen og bruges til omfattende vurdering af forskellig antipatogen immunreaktivitet i serumprøver. Klassificeringskanalen identificerer hvert enkelt perlesæt (dvs. specifikt antigen) og måler fluorescensen forbundet med IgG eller IgM mod dette antigen. Det resulterende multiplex-assay sparer tid og ressourcer i forhold til mindre omfattende klassisk test og katalogiserer nøjagtigt borrelia-immunreaktivitet i begrænsede prøvevolumener. Mens en lignende dobbeltreportertilgang tidligere er blevet brugt til at kategorisere immunresponser i andre patologier såsom SARS-CoV-2-infektion13, beskriver denne rapport anvendelsen af multiplexfluorescerende assay-teknologi til karakterisering af immunreaktivitet i Lyme borreliose.
Denne rapport fremhæver udviklingen af et to-reporter perlebaseret Borrelia-immunoassay, der reproducerbart og følsomt bestemmer anti-Borrelia-immunreaktivitet i serumprøver12. De forskellige patogene Borrelia-arter, der forårsager borreliose, kan differentieres ved variantspecifik antigenheterogenitet 6,7,8,9. Det multipleksede assay evaluerer samtidig IgG- og IgM-medieret anti-Borrelia-immunreaktivitet inden for den samme reaktionsbrønd og bevarer derved reagenser, arbejdskraft og prøvemateriale, der ellers er nødvendigt for at udføre to enkeltplex-assays separat. Sammenligning af IgM- og IgG-responser over tid kan muliggøre bedre sporing af sygdomsprogression, da IgM-til-IgG-serokonversion opstår efter infektion6.
Dual-reporter-systemet bruger to forskellige detektionsantistofsystemer13,15. Relaterede eksperimenter viste ingen signifikant påviselig krydsreaktivitet mellem Borrelia anti-IgM og anti-IgG detektionssystemer, når begge antistofklasser blev analyseret sammen i samme reaktionsbrønd12. I betragtning af den lavere bindingsaffinitet af IgM versus IgG-antistoffer16,17 valgte vi et PE-konjugeret detektionsantistof til IgM-detektion (den første reporterkanal i dobbeltreporterinstrumentet), fordi PE er en af de stærkest emitterende fluoroforer, der rutinemæssigt anvendes i immunoassays18. Til IgG-evaluering brugte vi et biotinyleret detektionsantistof, der efterfølgende blev belyst med BV421-konjugeret streptavidin (instrumentets anden reporterkanal)19. På trods af det ekstra inkubationstrin på 30 minutter sammenlignet med enkeltreportersystemet giver dobbeltreportersystemet dobbelt så mange oplysninger pr. reaktion. Samlet set kræver multiplexanalysen med dobbelt reporter mindre kumulativ tid og materialeinput end at køre to enkeltreporteranalyser.
Den stærke ydeevne og stabilitet af det multipleksede Borrelia-assay blev eksemplificeret ved høj reproducerbarhed i præcisionsundersøgelser inden for og mellem assay og ved påvisning af fortyndingslinearitet og fortyndingsparallelisme over en lang række prøvekoncentrationer til både IgG- og IgM-vurdering. Vi observerede højere absolutte fluorescensemissionsniveauer for de samme fluoroforer ved hjælp af enkeltkanalinstrumentet versus dobbeltkanalsystemet (≈1,7× højere med PE), hvilket kan tilskrives forskelle i optik og kalibreringsindstillinger mellem de to instrumenter (figur 4). Ikke desto mindre forblev fluorescensemissionskurverne med begge fluoroforer inden for det lineære område for begge instrumenter ved høje og lave prøvefortyndingsekstremer, og eventuelle uoverensstemmelser i den absolutte fluorescens, der blev målt, påvirkede ikke klassificeringen af Borrelia-eksponeringsstatus . 12
En stor fordel ved dette perlebaserede Borrelia-multiplexassay er, at analysen let kan modificeres eller udvides til at evaluere forskellige eller yderligere analysander, f.eks. til påvisning af antistoffer mod antigener fra yderligere Borrelia-arter . xMAP magnetiske perlesæt indeholder forskellige farvekombinationer, der kan skelnes i instrumentets klassificeringskanal og teoretisk kan implementeres i multiplexassays, der samtidig kan evaluere op til 500 unikke analysander inden for samme prøve. Mens den aktuelle undersøgelse fremhæver fire repræsentative Borrelia-antigener for at demonstrere analysefunktionalitet og stabilitet og for at sammenligne enkelt- og dobbeltrapporteringssystemet, undersøger det endelige assay otte antigener, der tilsammen kan identificere alle fem klinisk relevante Borrelia-patogener , der cirkulerer i hele Europa og Nordamerika12.
Høj kapacitet er mulig ved hjælp af standard 384-brønds mikrotiterplader i et halvautomatisk analyseformat. Assay og instrumentkompatibilitet med både 96- og 384-brøndplader gør det muligt at bruge Borrelia multiplex-analysen som et effektivt screeningsværktøj til hurtig analyse af store prøvesæt, såsom nationale undersøgelser20. Manuel udførelse af analysen er fortsat mulig for mindre prøvesæt, der bruger mindre plader med 96 brønde.
Studiets begrænsninger omfatter kun sammenlignende evaluering af nogle få Borrelia-immunreaktivitetsmål i et lille antal humane serumprøver. Den oprindelige undersøgelse bekræftede imidlertid, at analyseydelsen for både IgG og IgM blev opretholdt ved analyse af otte antigener fra alle fem kendte Borrelia-arter inden for et større prøvesæt12. Desuden kan dobbeltreporterinstrumentet kun vurdere to antistofisotyper samtidigt inden for hver reaktion, så fuldstændig isotypeprofilering ville nødvendiggøre udførelse af yderligere assayreaktioner13.
Afslutningsvis beskriver denne rapport den vellykkede fusion og omdannelse af perlebaserede enkeltreporterimmunoassays til dual-reporter-assays, der samtidig kan evaluere patogene Borrelia-specifikke IgG- og IgM-antistoffer i humane serumprøver. Denne kombinerede tilgang sparer samlet tid, materiale og arbejdsinput for at generere den samme datamængde som to uafhængige enkeltreporteranalyser. Multiplexanalysen kan skaleres fra 96-brønds til 384-brønds mikrotiterpladeformat og kan halvautomatiseres ved hjælp af robotplade- og væskehåndteringsinstrumentering, hvilket gør den velegnet til applikationer med høj kapacitet såsom store befolkningsundersøgelser. Perlebaserede dual-reporter-assaysystemer har tidligere vist nytte til evaluering af for eksempel immunresponser på andre virale og bakterielle patogener13,21, vurdering af allogene antistofresponser mod HLA-epitoper i organtransplantation22 og undersøgelse af mekanismer for autoimmun sygdom23. Den aktuelle rapport beskriver brugen af multiplexteknologi til at identificere eksponering for Borrelia-patogener, der forårsager borreliose, som et eksempel på, hvordan laboratorier kan tilpasse denne tilgang til at udforske komplekse immunmekanismer i forskellige patologier.
The authors have nothing to disclose.
Denne rapport blev finansieret af Luminex (Austin, TX). Forfatterne takker Matthew Silverman PhD (Biomedical Publishing Solutions, Panama City, FL; mattsilver@yahoo.com) for analytisk og videnskabelig redigeringsassistance. Forfatterne takker også Harald Klein og Christoph von Eichel-Streiber fra tgcBIOMICS GmbH (Bingen, Tyskland) for at levere Borrelia-antigenerne , der blev brugt i undersøgelsen. Humane serumprøver til teknisk assayvalidering og kvalitetskontrol blev opnået fra: 1) Multilocal and Serial Prevalence Study on Antibodies against SARS-CoV-2 i Tyskland via Department of Epidemiology, Helmholtz Center for Infection Research, Braunschweig, Tyskland; og 2)neurologisk afdeling, Sächsisches Krankenhaus Rodewisch (Rodewisch, Tyskland). Godkendelse til anvendelse af prøver fra mennesker blev givet af den etiske komité ved Hannover Medical School, Tyskland (9086_BO_S_2020).
Antibodies and Detection Reagents | Source | Catalog Number | |
Biotinylated Goat Anti-Human IgG | Jackson ImmunoResearch (Dianova) | 109-066-098 | |
Brilliant Violet 421-Streptavidin | BD Biosciences | 563259 | |
Donkey Anti-Human IgM | Jackson ImmunoResearch (Dianova) | 709-116-073 | |
Borrelia Antigens | tgcBIOMICS (Bingen, Germany) | ||
Coupling Reagents | |||
1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (EDC) | Thermo Scientific Pierce | 77149 ProteoChem (100 mg) | |
10x PBS | Fisher Scientific | BP399-4 | |
BSA | Carl Roth | T844.3 | |
MES (2-ethanesulfonic acid; zwitterionic buffer) | Carl Roth | 4256.2 | |
Na2HPO4 | Carl Roth | 4984.1 | |
ProClin300 | Sigma | 48914-U | |
Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) | Thermo Scientific Pierce | 24510 (500 mg) | |
Triton X-100 | Thermo Scientific | 85111 | |
Instrumentation and Ancillary Lab Supplies | Source | ||
384-well plate | Corning, Cat# 3570 | ||
96-well deep-well plates | ThermoFisher Scientific, Cat# 95040450 | ||
96-well half-area plates | Corning, Cat# 3690 | ||
BioTek 405 TS Plate Washer | BioTek Instruments/Agilent Technologies, Santa Clara, CA | ||
BioTek MultiFlo FX Plate Washer | BioTek Instruments/Agilent Technologies, Santa Clara, CA | ||
DynaMag Spin Magnet (for isolating beads in microcentrifuge tubes) | ThermoFisher, Cat# 12320D | ||
Flexmap 3D (two-channel, single-reporter instrument) | Luminex Corp., Austin, TX | ||
KingFisher Magnetic Particle Processor (for isolating beads in 96-well plates) | ThermoFisher, Cat# A31508 | ||
MagPlex Microspheres (magnetic, fluorescent, 6.5-µm-diameter beads) | Luminex Corp., Austin, TX | ||
SmartBlock Plates | Eppendorf, Cat# 5363000039 | ||
ThermoMixer C | Eppendorf, Cat# 5382000015 | ||
ThermoTop | Eppendorf, Cat# 5308000003 | ||
xMAP Intelliflex (three-channel, dual-reporter instrument) | Luminex Corp., Austin, TX |