Et trekanals dual-reporter fluorescensstrømningsanalysesystem ble brukt til å utvikle en perlebasert multipleximmunoassay som samtidig evaluerer serumprøver for IgG og IgM fremkalt mot flere antigener av forskjellige Borrelia-arter som forårsaker Lyme borreliose i Europa og Nord-Amerika.
For å overvåke utviklingen av smittsomme sykdommer er det nyttig å vurdere immunoreaktivitet mot ulike antigene determinanter, og måle forskjellige antistoffisotyper fordi de vises på forskjellige stadier av vertsimmunresponsen. Med Lyme borreliose kan det patogene middelet være et av flere medlemmer av Borrelia-arten . Korrekt prøveklassifisering krever derfor evaluering av immunreaktiviteten mot ulike antigener av ulike borreliaarter . I tillegg kan antipatogen IgG- og IgM-responser ha forskjellige fremkallingstidsforløp under sykdomsprogresjon. Her demonstrerer vi utviklingen av en to-reporter multiplex immunoassay som har nytte i å identifisere Borrelia-spesifikk immunrespons i humane serumprøver ved samtidig å evaluere både IgG og IgM immunoreaktivitet mot forskjellige bakterielle antigener i samme reaksjonsbrønn. Denne dual-reporter-tilnærmingen beholder den analytiske ytelsen til enkeltreportermetoder, samtidig som du sparer tid og ressurser og reduserer kravene til utvalgsstørrelse. Denne analysen tillater i hovedsak å doble den serologiske informasjonen som skal genereres fra en blodprøve på halvparten av tiden.
Lyme borreliose er den vanligste flåttbårne infeksjonssykdommen i moderat klima på den nordlige halvkule1. Det er forårsaket av spirochete bakterier av slekten Borrelia, med fem kjente humane patogener som varierer i geografisk fordeling2. De viktigste patogene borreliaartene i Europa er B. afzelii og B. garinii, med B. burgdorferi s.s., B. spielmanii og B. bavariensis mindre hyppig involvert. I Nord-Amerika er B. burgdorferi s.s. det eneste forårsakende middelet til Lyme borreliosis 2,3. Borreliapatogener overføres av medlemmer av flåttslekten Ixodes, med overføring som kan skje innen 24 timer etter flåttbitt4.
Lyme borreliose diagnose er vanligvis laget av kliniske symptomer og deretter bekreftet av serologi. I både Europa og Nord-Amerika anbefaler diagnostiske retningslinjer en to-trinns testserie bestående av en enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA) med refleksimmunblot for å evaluere antistoffrespons mot borreliaspesifikke antigener 1,5,6,7,8,9 . Denne tilnærmingen mangler imidlertid sensitivitet og er suboptimal, spesielt i tidlig fase av infeksjonen når serokonversjon kan være ufullstendig og anti-Borrelia IgG og IgM-titere er for lave6.
Multiplex immunoassays forbedrer tradisjonelle immunoassays som måler bare ett mål om gangen, og kan samtidig evaluere flere antistoffisotyperesponser mot ett eller flere antigener 10,11,12. Analyser som ELISA er begrenset til å identifisere og kvantifisere en enkelt analytt per reaksjon, i dette tilfellet enten sirkulerende IgG eller IgM indusert mot et enkelt bakterielt antigen etter infeksjon med Borrelia. Denne rapporten illustrerer bruk av perlebasert analyttprofileringsteknologi for utvikling av en multiplex immunoassay som samtidig påviser både IgG- og IgM-antistoffer mot noen av de her valgte Borrelia-antigenene i humane serumprøver. Vi valgte ut fire antigener som til sammen dekker de vanligste sykdomsfremkallende borreliaartene som hører hjemme i Europa (B. garinii, B. afzelii, B. burgdorferi s.s.) og Nord-Amerika (B. burgdorferi s.s.) (Tabell 1) 2,3. Dette tillater avgjørende patogenidentifikasjon og evnen til å skille tidlig IgM og senere, mer holdbar, IgG-immunoreaktivitet i pasientprøver.
Mål isotype | Reporter Channel | Antigen | Borrelia arter | Belastning | Konsentrasjon av antigenkobling |
Igm | PE | OspC | B. Garinii | 20047 | 5,0 μg/106 perler |
IgG | BV421 | VlsE | B. burgdorferi s.s | B31 | 1,25 μg/106 perler |
IgG | BV421 | DbpA | B. burgdorferi s.s. | ZS7 | 10,0 μg/106 perler |
IgG | BV421 | DbpA | B. afzelii | PKo | 5,0 μg/106 perler |
Tabell 1: Representative borreliaantigener brukt til utvikling av multipleksanalyser.
Vi utviklet opprinnelig en single-reporter immunoassay som oppdaget enten anti-Borrelia antigen IgG eller IgM-antistoffer i to separate reaksjoner og deretter fusjonerte disse analysene til en dual-reporter multiplex-analyse som måler begge antistoffisotyper i samme reaksjonsblanding. Magnetiske perler kobles til et patogenmålantigen av interesse, og inkuberes deretter med pasientens serumprøver. Det perlekoblede antigenet blir gjenkjent av, og fanger, både sirkulerende IgG og IgM i serum som genereres i en immunrespons mot det patogenantigenet. Analyse IgG versus IgM-spesifisitet bestemmes ved valg av et sekundært antistoff som binder seg til enten IgG eller IgM, hver med et distinkt fluoroforsignal assosiert med de to sekundære antistoffene. Hvert fluorescerende signal detekteres i en av instrumentets to Reporter-kanaler (dvs. dual-reporter) som har en annen eksitasjonslaser og utslippsfangst spesifikk for enkeltfluoroforen som brukes til å oppdage enten IgG eller IgM (her henholdsvis Brilliant Violet 421 eller phycoerythrin). Instrumentet Classification Channel identifiserer det fargekodede fargestoffet som er iboende i forskjellige perlesett. Dermed kan flere målantigener kobles til forskjellige fargede perler, og perlesettene blandes sammen og brukes til å vurdere omfattende mangfoldig antipatogen immunoreaktivitet i serumprøver. Klassifiseringskanalen identifiserer hvert enkelt perlesett (dvs. spesifikt antigen) og måler fluorescensen assosiert med IgG eller IgM mot det antigenet. Den resulterende multipleksanalysen sparer tid og ressurser sammenlignet med mindre omfattende klassisk testing og katalogiserer nøyaktig Lyme-immunoreaktivitet i begrensede prøvevolumer. Mens en lignende dual-reporter-tilnærming tidligere har blitt brukt til å kategorisere immunresponser i andre patologier som SARS-CoV-2-infeksjon13, beskriver denne rapporten anvendelsen av multiplex fluorescerende analyseteknologi for å karakterisere immunoreaktivitet i Lyme borreliose.
Denne rapporten belyser utviklingen av et perlebasert Borrelia-immunoassay med to reportere som reproduserbart og sensitivt påviser anti-Borrelia immunoreaktivitet i serumprøver12. De ulike sykdomsfremkallende borreliaartene som forårsaker borreliose kan differensieres ved variantspesifikk antigenheterogenitet 6,7,8,9. Den multipleksede analysen evaluerer samtidig IgG- og IgM-mediert anti-borrelia immunoreaktivitet innenfor samme reaksjonsbrønn, og sparer dermed reagenser, arbeidskraft og prøvemateriale som ellers trengs for å utføre to singleplex-analyser separat. Sammenligning av IgM- og IgG-responser over tid kan muliggjøre bedre sporing av sykdomsprogresjon ettersom IgM-til-IgG-serokonversjon oppstår etter infeksjon6.
Dual-reporter-systemet bruker to forskjellige deteksjonsantistoffsystemer 13,15. Relaterte eksperimenter viste ingen signifikant påviselig kryssreaktivitet mellom Borrelia anti-IgM og anti-IgG deteksjonssystemer når begge antistoffklassene ble analysert sammen i samme reaksjonsbrønn12. Med tanke på den lavere bindingsaffiniteten til IgM versus IgG-antistoffer16,17, valgte vi et PE-konjugert deteksjonsantistoff for IgM-deteksjon (den første reporterkanalen til dual-reporter-instrumentet) fordi PE er en av de sterkeste emitterende fluoroforene som rutinemessig brukes i immunoassays18. For IgG-evaluering brukte vi et biotinylert deteksjonsantistoff som deretter ble belyst med BV421-konjugert streptapavidin (instrumentets andre reporterkanal)19. Til tross for det ekstra inkubasjonstrinnet på 30 minutter sammenlignet med single-reporter-systemet, gir dual-reporter-systemet dobbelt så mye informasjon per reaksjon. Samlet sett krever multiplekset analyse med dobbel reporter mindre kumulativ tid og materialinndata enn å kjøre to enkeltreporteranalyser.
Sterk ytelse og stabilitet av den multipleksede Borrelia-analysen ble eksemplifisert ved høy reproduserbarhet i presisjonsstudier innen intra- og interanalyse, og ved demonstrasjon av fortynningslinearitet og fortynningsparallellitet over et bredt spekter av prøvekonsentrasjoner for både IgG- og IgM-vurdering. Vi observerte høyere absolutte fluorescensutslippsnivåer for de samme fluoroforene ved bruk av enkeltkanalsinstrumentet versus tokanalssystemet (≈1,7× høyere med PE), noe som kan tilskrives forskjeller i optikk og kalibreringsinnstillinger mellom de to instrumentene (figur 4). Likevel holdt fluorescensutslippskurver med begge fluoroforer seg innenfor det lineære området for begge instrumentene ved ekstreme høy- og lavprøvefortynninger, og eventuelle avvik i absolutt fluorescens som ble målt, påvirket ikke klassifiseringen av Borrelia-eksponeringsstatus . 12
En stor fordel med denne perlebaserte Borrelia multiplex-analysen er hvor enkelt analysen kan modifiseres eller utvides for å evaluere forskjellige eller ytterligere analytter, for eksempel for å oppdage antistoffer mot antigener av ytterligere Borrelia-arter . xMAP magnetiske dråpesett inneholder forskjellige fargestoffkombinasjoner som kan skilles i instrumentets klassifiseringskanal og kan teoretisk implementeres i multipleksanalyser som samtidig kan evaluere opptil 500 unike analytter i samme prøve. Mens den nåværende studien fremhever fire representative Borrelia-antigener for å demonstrere analysefunksjonalitet og stabilitet og for å sammenligne single- og dual-reporter-systemet, undersøker den endelige analysen åtte antigener som sammen kan identifisere alle fem klinisk relevante Borrelia-patogener som sirkulerer i hele Europa og Nord-Amerika12.
Høy gjennomstrømningsytelse er mulig ved bruk av standard 384-brønns mikrotiterplater i et halvautomatisk analyseformat. Analyse og instrumentkompatibilitet med både 96- og 384-brønnsplater gjør at Borrelia multiplex-analysen kan brukes som et effektivt screeningverktøy for rask analyse av store prøvesett, for eksempel nasjonale studier20. Manuell ytelse av analysen er fortsatt mulig for mindre prøvesett som bruker mindre 96-brønnsplater.
Studiebegrensninger inkluderer komparativ evaluering av bare noen få Borrelia immunoreaktivitetsmål i et lite antall humane serumprøver. Den opprinnelige studien bekreftet imidlertid at analyseytelsen for både IgG og IgM ble opprettholdt ved analyse av åtte antigener fra alle fem kjente Borrelia-arter i et større prøvesett12. Dual-reporter-instrumentet kan også bare vurdere to antistoffisotyper samtidig innenfor hver reaksjon, så fullstendig isotypeprofilering vil nødvendiggjøre å utføre ytterligere analysereaksjoner13.
Avslutningsvis beskriver denne rapporten den vellykkede sammenslåingen og konverteringen av perlebaserte enkeltreporterimmunoassays til dual-reporter-analyser som samtidig kan evaluere patogene Borrelia-spesifikke IgG- og IgM-antistoffer i humane serumprøver. Denne kombinerte tilnærmingen sparer total tid, materiale og arbeidsinndata for å generere samme datavolum som to uavhengige enkeltreporteranalyser. Multipleksanalysen kan skaleres fra 96-brønn til 384-brønns mikrotiterplateformat og kan halvautomatiseres ved bruk av robotplate- og væskehåndteringsinstrumentering, noe som gjør den egnet for applikasjoner med høy gjennomstrømning som store befolkningsundersøkelser. Perlebaserte dual-reporter-analysesystemer har tidligere vist nytte i å evaluere for eksempel immunresponser mot andre virale og bakterielle patogener13,21, vurdere allogene antistoffresponser mot HLA-epitoper i organtransplantasjon22 og utforske mekanismer for autoimmun sykdom23. Den nåværende rapporten detaljerte bruken av multiplex-teknologi for å identifisere eksponering for Borrelia-patogener som forårsaker Lyme-sykdommen, som et eksempel på hvordan laboratorier kan tilpasse denne tilnærmingen for å utforske komplekse immunmekanismer i ulike patologier.
The authors have nothing to disclose.
Denne rapporten ble finansiert av Luminex (Austin, TX). Forfatterne takker Matthew Silverman PhD (Biomedical Publishing Solutions, Panama City, FL; mattsilver@yahoo.com) for analytisk og vitenskapelig redigeringshjelp. Forfatterne takker også Harald Klein og Christoph von Eichel-Streiber fra tgcBIOMICS GmbH (Bingen, Tyskland) for å gi Borrelia-antigenene som ble brukt i studien. Humane serumprøver for teknisk analysevalidering og kvalitetskontroll ble hentet fra: 1) Multilocal and Serial Prevalence Study on Antibodies against SARS-CoV-2 i Tyskland via Department of Epidemiology, Helmholtz Centre for Infection Research, Braunschweig, Tyskland; og 2)Nevrologisk institutt, Sächsisches Krankenhaus Rodewisch (Rodewisch, Tyskland). Godkjenning for bruk av humane prøver ble gitt av den etiske komiteen ved Hannover Medical School, Tyskland (9086_BO_S_2020).
Antibodies and Detection Reagents | Source | Catalog Number | |
Biotinylated Goat Anti-Human IgG | Jackson ImmunoResearch (Dianova) | 109-066-098 | |
Brilliant Violet 421-Streptavidin | BD Biosciences | 563259 | |
Donkey Anti-Human IgM | Jackson ImmunoResearch (Dianova) | 709-116-073 | |
Borrelia Antigens | tgcBIOMICS (Bingen, Germany) | ||
Coupling Reagents | |||
1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (EDC) | Thermo Scientific Pierce | 77149 ProteoChem (100 mg) | |
10x PBS | Fisher Scientific | BP399-4 | |
BSA | Carl Roth | T844.3 | |
MES (2-ethanesulfonic acid; zwitterionic buffer) | Carl Roth | 4256.2 | |
Na2HPO4 | Carl Roth | 4984.1 | |
ProClin300 | Sigma | 48914-U | |
Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) | Thermo Scientific Pierce | 24510 (500 mg) | |
Triton X-100 | Thermo Scientific | 85111 | |
Instrumentation and Ancillary Lab Supplies | Source | ||
384-well plate | Corning, Cat# 3570 | ||
96-well deep-well plates | ThermoFisher Scientific, Cat# 95040450 | ||
96-well half-area plates | Corning, Cat# 3690 | ||
BioTek 405 TS Plate Washer | BioTek Instruments/Agilent Technologies, Santa Clara, CA | ||
BioTek MultiFlo FX Plate Washer | BioTek Instruments/Agilent Technologies, Santa Clara, CA | ||
DynaMag Spin Magnet (for isolating beads in microcentrifuge tubes) | ThermoFisher, Cat# 12320D | ||
Flexmap 3D (two-channel, single-reporter instrument) | Luminex Corp., Austin, TX | ||
KingFisher Magnetic Particle Processor (for isolating beads in 96-well plates) | ThermoFisher, Cat# A31508 | ||
MagPlex Microspheres (magnetic, fluorescent, 6.5-µm-diameter beads) | Luminex Corp., Austin, TX | ||
SmartBlock Plates | Eppendorf, Cat# 5363000039 | ||
ThermoMixer C | Eppendorf, Cat# 5382000015 | ||
ThermoTop | Eppendorf, Cat# 5308000003 | ||
xMAP Intelliflex (three-channel, dual-reporter instrument) | Luminex Corp., Austin, TX |