Ett trekanaligt dubbelrapportör fluorescensflödesanalyssystem användes för att utveckla en pärlbaserad multiplex immunanalys som samtidigt utvärderar serumprover för IgG och IgM framkallade mot flera antigener av olika Borrelia-arter som orsakar Lyme borrelios i Europa och Nordamerika.
För att övervaka utvecklingen av infektionssjukdomar är det användbart att bedöma immunreaktivitet mot olika antigena determinanter och mäta olika antikroppsisotyper eftersom de uppträder i olika stadier av värdens immunsvar. När det gäller borrelia kan det patogena ämnet vara en av de många medlemmarna av Borrelia-arten . En korrekt provklassificering kräver därför att immunreaktiviteten mot olika antigener hos olika Borrelia-arter utvärderas. Dessutom kan antipatogena IgG- och IgM-svar ha olika eliciteringstidsförlopp under sjukdomsprogression. Här demonstrerar vi utvecklingen av en multiplex immunoassay med två rapportörer som har nytta för att identifiera Borrelia-specifikt immunsvar i humana serumprover genom att samtidigt utvärdera både IgG- och IgM-immunreaktivitet mot olika bakteriella antigener i samma reaktionsbrunn. Denna metod med dubbla rapportörer bibehåller den analytiska prestandan hos metoder med en rapportör samtidigt som tid och resurser sparas och kraven på stickprovsstorlek minskar. Denna analys gör det möjligt att generera i princip dubbelt så mycket serologisk information från ett blodprov på halva tiden.
Borrelia borrelios är den vanligaste fästingburna infektionssjukdomen i måttliga klimat på norra halvklotet. Den orsakas av spiroketbakterier av släktet Borrelia, med fem kända humanpatogener som varierar i geografisk utbredning2. De viktigaste patogena borreliaarterna i Europa är B. afzelii och B. garinii, medan B. burgdorferi s.s., B. spielmanii och B. bavariensis är mer sällsynta. I Nordamerika är B. burgdorferi s.s. den enda orsaken till Lyme borreliosis 2,3. Borreliapatogener överförs av medlemmar av fästingsläktet Ixodes, och överföringen kan ske inom 24 timmar efter fästingbett4.
Diagnosen borrelia ställs vanligtvis av kliniska symtom och bekräftas därefter av serologi. I både Europa och Nordamerika rekommenderar diagnostiska riktlinjer en testserie i två steg bestående av en enzymkopplad immunadsorberande analys (ELISA) med en refleximmunoblot för att utvärdera antikroppssvar mot Borrelia-specifika antigener 1,5,6,7,8,9 . Detta tillvägagångssätt saknar dock känslighet och är suboptimalt, särskilt i den tidiga fasen av infektionen när serokonversionen kan vara ofullständig och anti-Borrelia IgG- och IgM-titrar är för låga6.
Multiplexa immunanalyser förbättrar traditionella immunanalyser som endast mäter ett mål åt gången och kan samtidigt utvärdera flera antikroppsisotypsvar mot ett eller flera antigen 10,11,12. Analyser som ELISA är begränsade till att identifiera och kvantifiera en enda analyt per reaktion, i det aktuella fallet antingen cirkulerande IgG eller IgM inducerad mot ett enda bakteriellt antigen efter infektion med Borrelia. Denna rapport illustrerar användningen av pärlbaserad analytprofileringsteknik för utveckling av en multiplex immunanalys som samtidigt detekterar både IgG- och IgM-antikroppar mot något av de här utvalda Borrelia-antigenerna i humana serumprover. Vi valde ut fyra antigener som tillsammans täcker de vanligaste patogena Borrelia-arterna som är inhemska i Europa (B. garinii, B. afzelii, B. burgdorferi s.s.) och Nordamerika (B. burgdorferi s.s.) (Tabell 1) 2,3. Detta möjliggör avgörande identifiering av patogener och förmågan att urskilja tidig IgM och senare, mer varaktig, IgG-immunreaktivitet i patientprover.
Mål isotyp | Reporter Kanal | Antigen | Borrelia-arter | Anstränga | Koncentration av antigenkoppling |
Igm | PE | OspC | B. garinii | 20047 | 5,0 μg/106 pärlor |
IgG | BV421 | VlsE | B. burgdorferi s.s | B31 (B31) | 1,25 μg/106 pärlor |
IgG | BV421 | DbpA (på engelska) | B. burgdorferi s.s. | ZS7 | 10,0 μg/106 pärlor |
IgG | BV421 | DbpA (på engelska) | B. afzelii | PKo | 5,0 μg/106 pärlor |
Tabell 1: Representativa Borrelia-antigener som används för utveckling av multiplexa analyser.
Vi utvecklade initialt en immunoanalys med en reporter som detekterade antingen anti-Borrelia-antigen IgG- eller IgM-antikroppar i två separata reaktioner och slog sedan samman dessa analyser till en multiplexanalys med dubbla rapportörer som mäter båda antikroppsisotyperna i samma reaktionsblandning. Magnetiska pärlor kopplas till ett patogent målantigen av intresse och inkuberas sedan med patientserumprover. Det pärlkopplade antigenet känns igen av, och fångar upp, både cirkulerande IgG och IgM i serum som genereras i ett immunsvar mot det patogena antigenet. Bestämning av IgG kontra IgM-specificitet bestäms genom valet av en sekundär antikropp som binder till antingen IgG eller IgM, var och en med en distinkt fluoroforsignal associerad med de två sekundära antikropparna. Varje fluorescerande signal detekteras i en av instrumentets två reporterkanaler (dvs. dubbelreporter) som har en annan excitationslaser och emissionsavskiljning som är specifik för den enda fluoroforen som används för att detektera antingen IgG eller IgM (här Brilliant Violet 421 respektive fykoerytrin). Instrumentets klassificeringskanal identifierar det färgkodade färgämnet som är inneboende i olika stränguppsättningar. Således kan flera målantigener kopplas till olikfärgade pärlor, och pärluppsättningarna blandas ihop och användas för att på ett heltäckande sätt bedöma olika antipatogena immunreaktivitet i serumprover. Klassificeringskanalen identifierar varje enskild pärluppsättning (dvs. specifikt antigen) och mäter fluorescensen associerad med IgG eller IgM mot det antigenet. Den resulterande multiplexanalysen sparar tid och resurser jämfört med mindre omfattande klassisk testning och katalogiserar noggrant Lyme-borrelios immunreaktivitet i begränsade provvolymer. Medan en liknande dual-reporter-metod tidigare har använts för att kategorisera immunsvar i andra patologier såsom SARS-CoV-2-infektion13, beskriver denna rapport tillämpningen av multiplex fluorescerande analysteknik för att karakterisera immunreaktivitet vid Lyme borrelios.
Denna rapport belyser utvecklingen av en två-rapportör pärlbaserad Borrelia immunanalys som reproducerbart och känsligt bestämmer anti-Borrelia immunreaktivitet i serumprover12. De olika patogena borreliaarterna som orsakar borrelia kan särskiljas genom variantspecifik antigenheterogenitet 6,7,8,9. Den multiplexerade analysen utvärderar samtidigt IgG- och IgM-medierad anti-Borrelia-immunreaktivitet inom samma reaktionsbrunn, och bevarar därigenom reagenser, arbetskraft och provmaterial som annars behövs för att utföra två singleplex-analyser separat. Jämförelse av IgM- och IgG-svar över tid kan möjliggöra bättre spårning av sjukdomsprogression eftersom IgM-till-IgG-serokonversion inträffar efter infektion6.
Systemet med dubbla rapportörer använder två olika detektionsantikroppssystem13,15. Relaterade experiment visade ingen signifikant detekterbar korsreaktivitet mellan Borrelia anti-IgM- och anti-IgG-detektionssystem när båda antikroppsklasserna analyserades tillsammans i samma reaktionsbrunn12. Med tanke på den lägre bindningsaffiniteten hos IgM jämfört med IgG-antikroppar16,17 valde vi en PE-konjugerad detektionsantikropp för IgM-detektion (den första reporterkanalen för instrumentet med dubbla rapportörer) eftersom PE är en av de starkast emitterande fluoroforerna som rutinmässigt används i immunanalyser18. För IgG-utvärdering använde vi en biotinylerad detektionsantikropp som därefter belystes med BV421-konjugerat streptavidin (instrumentets andra rapportkanal)19. Trots det extra inkubationssteget på 30 minuter jämfört med systemet med en rapportör, ger systemet med dubbla rapportörer dubbelt så mycket information per reaktion. Sammantaget kräver den multiplexerade analysen med dubbla rapportörer mindre kumulativ tid och materialinmatningar än att köra två analyser med en rapportör.
Stark prestanda och stabilitet hos den multiplexerade Borrelia-analysen exemplifierades av hög reproducerbarhet i precisionsstudier inom och mellan analyser, och genom demonstration av utspädningslinjäritet och utspädningsparallellitet över ett brett spektrum av provkoncentrationer för både IgG- och IgM-bedömning. Vi observerade högre absoluta fluorescensemissionsnivåer för samma fluoroforer med enkanalsinstrumentet jämfört med tvåkanalssystemet (≈1,7× högre med PE), vilket kan tillskrivas skillnader i optik och kalibreringsinställningar mellan de två instrumenten (figur 4). Icke desto mindre förblev fluorescensemissionskurvorna med båda fluoroforerna inom det linjära intervallet för båda instrumenten vid höga och låga utspädningsextremer, och eventuella avvikelser i uppmätt absolut fluorescens påverkade inte klassificeringen av borreliaexponeringsstatus . 12
En stor fördel med denna pärlbaserade Borrelia multiplex-analys är den lätthet med vilken analysen kan modifieras eller utökas för att utvärdera olika eller ytterligare analyter, t.ex. för att detektera antikroppar mot antigener från ytterligare Borrelia-arter . xMAP magnetiska pärluppsättningar innehåller olika färgkombinationer som kan särskiljas i instrumentets klassificeringskanal och kan teoretiskt implementeras i multiplexanalyser som samtidigt kan utvärdera upp till 500 unika analyter inom samma prov. Medan den aktuella studien lyfter fram fyra representativa Borrelia-antigener för att demonstrera analysens funktionalitet och stabilitet och för att jämföra single- och dual-reporter-systemet, undersöker den slutliga analysen åtta antigener som tillsammans kan identifiera alla fem kliniskt relevanta Borrelia-patogener som cirkulerar i Europa och Nordamerika12.
Hög genomströmningsprestanda är möjlig med hjälp av standard 384-håls mikrotiterplattor i ett halvautomatiskt analysformat. Analys- och instrumentkompatibilitet med både 96- och 384-brunnsplattor gör att Borrelia-multiplexanalysen kan användas som ett effektivt screeningverktyg för att snabbt analysera stora provuppsättningar, såsom nationella studier20. Manuell utförande av analysen är fortfarande möjlig för mindre provuppsättningar med mindre 96-hålsplattor.
Studiens begränsningar inkluderar jämförande utvärdering av endast ett fåtal Borrelia-immunreaktivitetsmål i ett litet antal humana serumprover. Den ursprungliga studien bekräftade dock att analysprestanda för både IgG och IgM bibehölls vid analys av åtta antigener från alla fem kända Borrelia-arter inom en större provuppsättning12. Dessutom kan instrumentet med dubbla rapportörer endast bedöma två antikroppsisotyper samtidigt inom varje reaktion, så fullständig isotypprofilering skulle kräva att ytterligare analysreaktioner utförs13.
Sammanfattningsvis beskriver denna rapport den framgångsrika sammanslagningen och omvandlingen av pärlbaserade single-reporter immunoassays till dual-reporter-analyser som samtidigt kan utvärdera patogena Borrelia-specifika IgG- och IgM-antikroppar i humana serumprover. Detta kombinerade tillvägagångssätt sparar total tid, material och arbetsinsatser för att generera samma datavolym som två oberoende analyser med en rapportör. Multiplexanalysen kan skalas från 96-brunnars till 384-brunnars mikrotiterplattformat och kan halvautomatiseras med hjälp av robotplatt- och vätskehanteringsinstrument, vilket gör den lämplig för applikationer med hög genomströmning som stora befolkningsundersökningar. Pärlbaserade analyssystem med dubbla rapportörer har tidigare visat sig vara användbara för att utvärdera till exempel immunsvar mot andra virala och bakteriella patogener13,21, bedöma allogena antikroppssvar mot HLA-epitoper vid organtransplantation22 och utforska mekanismer för autoimmun sjukdom23. Den aktuella rapporten beskriver användningen av multiplexteknik för att identifiera exponering för Borrelia-patogener som orsakar Lyme-borrelios, som ett exempel på hur laboratorier kan anpassa detta tillvägagångssätt för att utforska komplexa immunmekanismer i olika patologier.
The authors have nothing to disclose.
Denna rapport finansierades av Luminex (Austin, TX). Författarna tackar Matthew Silverman, PhD (Biomedical Publishing Solutions, Panama City, Florida; mattsilver@yahoo.com) för analytisk och vetenskaplig redigeringshjälp. Författarna tackar också Harald Klein och Christoph von Eichel-Streiber från tgcBIOMICS GmbH (Bingen, Tyskland) för att ha tillhandahållit de Borrelia-antigener som användes i studien. Humana serumprover för teknisk analysvalidering och kvalitetskontroll erhölls från: 1) Multilocal and Serial Prevalence Study on Antibodies against SARS-CoV-2 i Tyskland via Department of Epidemiology, Helmholtz Centre for Infection Research, Braunschweig, Tyskland; och 2)Neurologiska kliniken, Sächsisches Krankenhaus Rodewisch (Rodewisch, Tyskland). Godkännande för användning av humanprover beviljades av etikkommittén vid Hannover Medical School, Tyskland (9086_BO_S_2020).
Antibodies and Detection Reagents | Source | Catalog Number | |
Biotinylated Goat Anti-Human IgG | Jackson ImmunoResearch (Dianova) | 109-066-098 | |
Brilliant Violet 421-Streptavidin | BD Biosciences | 563259 | |
Donkey Anti-Human IgM | Jackson ImmunoResearch (Dianova) | 709-116-073 | |
Borrelia Antigens | tgcBIOMICS (Bingen, Germany) | ||
Coupling Reagents | |||
1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (EDC) | Thermo Scientific Pierce | 77149 ProteoChem (100 mg) | |
10x PBS | Fisher Scientific | BP399-4 | |
BSA | Carl Roth | T844.3 | |
MES (2-ethanesulfonic acid; zwitterionic buffer) | Carl Roth | 4256.2 | |
Na2HPO4 | Carl Roth | 4984.1 | |
ProClin300 | Sigma | 48914-U | |
Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) | Thermo Scientific Pierce | 24510 (500 mg) | |
Triton X-100 | Thermo Scientific | 85111 | |
Instrumentation and Ancillary Lab Supplies | Source | ||
384-well plate | Corning, Cat# 3570 | ||
96-well deep-well plates | ThermoFisher Scientific, Cat# 95040450 | ||
96-well half-area plates | Corning, Cat# 3690 | ||
BioTek 405 TS Plate Washer | BioTek Instruments/Agilent Technologies, Santa Clara, CA | ||
BioTek MultiFlo FX Plate Washer | BioTek Instruments/Agilent Technologies, Santa Clara, CA | ||
DynaMag Spin Magnet (for isolating beads in microcentrifuge tubes) | ThermoFisher, Cat# 12320D | ||
Flexmap 3D (two-channel, single-reporter instrument) | Luminex Corp., Austin, TX | ||
KingFisher Magnetic Particle Processor (for isolating beads in 96-well plates) | ThermoFisher, Cat# A31508 | ||
MagPlex Microspheres (magnetic, fluorescent, 6.5-µm-diameter beads) | Luminex Corp., Austin, TX | ||
SmartBlock Plates | Eppendorf, Cat# 5363000039 | ||
ThermoMixer C | Eppendorf, Cat# 5382000015 | ||
ThermoTop | Eppendorf, Cat# 5308000003 | ||
xMAP Intelliflex (three-channel, dual-reporter instrument) | Luminex Corp., Austin, TX |