小鼠徒手脑室内注射
Summary
在这里，描述了一种使用徒手方法（即没有立体定位装置）在小鼠中进行脑室内注射的简单快速的方法。
Abstract
神经内分泌系统的研究通常需要将药物、病毒或其他实验剂直接输送到小鼠的大脑中。脑室内 （ICV） 注射允许实验药物在整个大脑中广泛递送（特别是在心室附近的结构中）。在这里，描述了在成年小鼠中进行徒手ICV注射的方法。通过在小鼠头部使用视觉和触觉标志，可以快速可靠地向侧脑室注射。注射是用实验者手中的玻璃注射器进行的，并放置在与地标大致距离的地方。因此，该技术不需要立体定位框架。此外，该技术只需要短暂的异氟醚麻醉，这允许随后评估清醒、行为自由的小鼠的小鼠行为和/或生理学。徒手ICV注射是将实验剂有效输送到活体小鼠大脑中的强大工具，可以与其他技术相结合，如频繁的血液采样、神经回路操作或 体内 记录，以研究神经内分泌过程。
Introduction
将实验药物（如药物1、病毒2 或细胞3）输送到大脑通常是神经内分泌研究所必需的。如果该药剂不容易穿过血脑屏障，或者实验目标是专门测试药剂的中枢作用，那么有一种可靠的方法将注射剂输送到大脑中是很重要的。此外，注射到脑室内 （ICV） 空间提供了将药物广泛分布在大脑中的机会，并提供了较大的靶区，从而增加了成功注射的可能性2.
进行 ICV 注射的常用方法是放置永久性留置插管。在这种方法中，需要立体定位框架来定位市售或定制的套管，因为套管被粘合或胶合到位。通常，在康复后，通过套管给予超生理剂量的血管紧张素 II，如果立即观察到饮酒行为，则认为套管放置正确4.这种方法具有许多优点，包括能够进行长期输注和多次注射同一只动物的能力;此外，如果使用血管紧张素II，则可以在施用实验化合物之前确认正确的放置。然而，放置永久性插管存在一些局限性，包括对昂贵设备（立体定位框架）的要求、放置后插管损坏的可能性（例如，小鼠可以咀嚼笼子伴侣的插管）以及永久性插管周围感染的可能性。可以使用立体定位框架3 进行单次 ICV 注射，这虽然有效，但需要大量暴露于麻醉，因此可能会掩盖治疗的一些急性生理和行为影响。此外，将小鼠放置在立体定位框架中需要大量训练才能实现稳定放置并防止耳道破裂。
在这里，描述了一种在小鼠中进行徒手注射的既定方法。这种方法基于以前的报告5,6。这种技术的优点是简单、快速，不需要立体定位框架等专用设备。如下所述，该过程涉及操纵玻璃注射器相对于小鼠头部的标志进行注射，这可以快速完成，因此在实验当天只需要几分钟的气体麻醉。
Protocol
Representative Results
Discussion
在这里，描述了一种在小鼠中进行ICV注射的简单有效的方法。由于该技术不需要立体定向框架，因此这种用于药物和实验剂集中递送的方法可供更多研究人员使用。此外，这种方法的通量相对较高，因为制备和注射程序可以快速执行。
由于此过程需要使用近似距离手动操作针头和玻璃注射器，因此建议新从业者在与活体动物一起工作之前花一些时间练习这些动作。此外，小?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们要感谢 Kellie Breen Church 博士、Michael Kreisman 先生和 Jessica Jang 女士为收集代表性结果中显示的数据所做的贡献。这项工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）R00 HD104994（R.B.M.）的支持。
Materials
| 18-gauge blunt needles | SAI Infusion | B18-150 | |
| 18-gauge needles | BD Medical | 305195 | |
| Alcohol pads | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Bench pad | Fisher Scientific | 14-206-62AC22 | |
| Betadine solution | Fisher Scientific | NC1696484 | |
| Buprenorphine | Patterson Vet Supply | 07-892-5235 | Controlled substance |
| Eyelube | Fisher Scientific | 50-218-8442 | |
| Glass syringe | Hamilton | 7634-01 | |
| Injection needle | Hamilton | 7803-01 | 27 gauge, Small Hub RN needle, point style: 4, Needle length: 10cm, Angle: 45 |
| Isoflurane | Patterson Vet Supply | 07-893-8441 | |
| Isoflurane vaporizer | Vet Equip | V-10 | |
| Laboratory Tape | VWR | 89098-128 | |
| Medical grade oxygen | Airgas | OX USPEA | |
| Paraformaldehyde | Millipore-Sigma | 8.18715.1000 | |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | J67802.K2 | |
| PulsaR Software | Open source, University of Otago | See ref 9 | |
| Ruler | Fisher Scientific | 12-00-152 | |
| Silastic tubing (0.040" I.D.) | DOW | 508-005 | |
| Silastic tubing (0.078" I.D.) | DOW | 508-009 | |
| Sterile saline | VWR | 101320-574 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 |
Referências
- Roseweir, A. K., et al. Discovery of potent kisspeptin antagonists delineate physiological mechanisms of gonadotropin regulation. Journal of Neuroscience. 29 (12), 3920-3929 (2009).
- Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. Journal of Visualized Experiments. (91), e51863 (2014).
- Taylor, Z. V., Khand, B., Porgador, A., Monsonego, A., Eremenko, E. An optimized intracerebroventricular injection of CD4(+) T cells into mice. STAR Protocols. 2 (3), 100725 (2021).
- Russo, K. A., et al. Circadian control of the female reproductive axis through gated responsiveness of the RFRP-3 system to VIP signaling. Endocrinology. 156 (7), 2608-2618 (2015).
- Laursen, S. E., Belknap, J. K. Intracerebroventricular injections in mice. Some methodological refinements. Journal of Pharmacological Methods. 16 (4), 355-357 (1986).
- Haley, T. J., McCormick, W. G. Pharmacological effects produced by intracerebral injection of drugs in the conscious mouse. British Journal of Pharmacology and Chemotherapy. 12 (1), 12-15 (1957).
- McCosh, R. B., et al. Insulin-induced hypoglycaemia suppresses pulsatile luteinising hormone secretion and arcuate Kiss1 cell activation in female mice. Journal of Neuroendocrinology. 31 (12), e12813 (2019).
- Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio-Protocol. 11 (5), e3988 (2021).
- Comba, A., et al. Laser capture microdissection of glioma subregions for spatial and molecular characterization of intratumoral heterogeneity, oncostreams, and invasion. Journal of Visual Experiments. (158), e60939 (2020).
- Porteous, R., et al. Reformulation of PULSAR for analysis of pulsatile LH secretion and a revised model of estrogen-negative feedback in mice. Endocrinology. 162 (11), (2021).
- Hohmann, J. G., et al. Differential role of melanocortins in mediating leptin’s central effects on feeding and reproduction. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative, and Comparative Physiology. 278 (1), R50-R59 (2000).
- Gottsch, M. L., et al. A role for kisspeptins in the regulation of gonadotropin secretion in the mouse. Endocrinology. 145 (9), 4073-4077 (2004).
- Krasnow, S. M., et al. A role for galanin-like peptide in the integration of feeding, body weight regulation, and reproduction in the mouse. Endocrinology. 144 (3), 813-822 (2003).
