Frihånds intracerebroventrikulære injektioner hos mus
Summary
Her beskrives en enkel og hurtig tilgang til udførelse af intracerebroventrikulære injektioner hos mus ved hjælp af en frihåndstilgang (det vil sige uden stereotaksisk enhed).
Abstract
Undersøgelsen af neuroendokrine systemer kræver ofte levering af lægemidler, vira eller andre eksperimentelle midler direkte ind i hjernen hos mus. En intracerebroventrikulær (ICV) injektion tillader udbredt levering af det eksperimentelle middel i hele hjernen (især i strukturerne nær ventriklerne). Her beskrives metoder til fremstilling af frihånds ICV-injektioner hos voksne mus. Ved at bruge visuelle og taktile landemærker på musenes hoveder kan injektioner i laterale ventrikler foretages hurtigt og pålideligt. Injektionerne er lavet med en glassprøjte holdt i eksperimentatorens hånd og placeret i omtrentlige afstande fra landemærkerne. Således kræver denne teknik ikke en stereotaksisk ramme. Desuden kræver denne teknik kun kort isofluranbedøvelse, som muliggør efterfølgende vurdering af museadfærd og/eller fysiologi hos vågne, frit opførte mus. Frihånds ICV-injektion er et kraftfuldt værktøj til effektiv levering af eksperimentelle midler i hjernen hos levende mus og kan kombineres med andre teknikker såsom hyppig blodprøvetagning, neurale kredsløbsmanipulation eller in vivo-optagelse for at undersøge neuroendokrine processer.
Introduction
Levering af eksperimentelle midler, såsom medicin1, vira2 eller celler3, til hjernen er ofte nødvendig for neuroendokrin forskning. Hvis midlet ikke let krydser blod-hjerne-barrieren, eller det eksperimentelle mål er specifikt at teste de centrale virkninger af midlet, er det vigtigt at have en pålidelig metode til at levere injektioner i hjernen. Desuden giver injektion i det intracerebroventrikulære (ICV) rum mulighed for at distribuere midlet bredt i hjernen og giver et stort målområde, hvilket øger sandsynligheden for vellykket injektion2.
En almindelig metode til fremstilling af ICV-injektioner involverer placering af en permanent indlagt kanyle. I denne tilgang er en stereotaksisk ramme nødvendig for at placere den kommercielt tilgængelige eller specialfremstillede kanyle, da kanylen limes eller cementeres på plads. Ofte administreres en suprafysiologisk dosis angiotensin II ved genopretning gennem kanylen, og hvis drikkeadfærd straks observeres, betragtes kanylen som korrekt placeret4. Denne tilgang har mange fordele, herunder evnen til at udføre langvarig infusion og evnen til at injicere det samme dyr flere gange; Derudover, hvis angiotensin II anvendes, kan korrekt placering bekræftes før administration af eksperimentelle forbindelser. Der er dog nogle begrænsninger for placering af en permanent kanyle, herunder kravet om dyrt udstyr (stereotaksisk ramme), muligheden for beskadigelse af kanylen efter placering (f.eks. Mus kan tygge på kanylen på en burkammerat) og muligheden for infektioner omkring den permanente kanyle. Enkelt ICV-injektioner kan foretages ved brug af en stereotaksisk ramme3, som, selvom den er effektiv, kræver betydelig eksponering for anæstesi og dermed kan skjule nogle akutte fysiologiske og adfærdsmæssige virkninger af behandlingen. Derudover kræver placeringen af mus i en stereotaksisk ramme betydelig træning for at opnå stabil placering og forhindre brud på øregangene.
Her beskrives en etableret metode til fremstilling af frihåndsinjektioner hos mus. Denne metode er baseret på tidligere rapporter 5,6. Fordelene ved denne teknik er, at den er enkel, hurtig og ikke kræver specialudstyr såsom en stereotaksisk ramme. Som beskrevet nedenfor involverer denne procedure manipulation af en glassprøjte i forhold til landemærker på musehovedet for at foretage injektionerne, hvilket kan gøres hurtigt og dermed kun kræver et par minutters gasbedøvelse på forsøgsdagen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her beskrives et enkelt og effektivt middel til fremstilling af ICV-injektioner hos mus. Da denne teknik ikke kræver en stereotaxisk ramme, er denne tilgang til central levering af lægemidler og eksperimentelle midler tilgængelig for flere forskere. Derudover er denne tilgang relativt høj gennemstrømning, da forberedelses- og injektionsproceduren kan udføres hurtigt.
Da denne procedure kræver manipulation af nåle og en glassprøjte i hånden ved hjælp af omtrentlige afstande, anbefale…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke Dr. Kellie Breen Church, Mr. Michael Kreisman og Jessica Jang for deres bidrag til at indsamle de data, der vises i de repræsentative resultater. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (NIH) R00 HD104994 (R.B.M.).
Materials
| 18-gauge blunt needles | SAI Infusion | B18-150 | |
| 18-gauge needles | BD Medical | 305195 | |
| Alcohol pads | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Bench pad | Fisher Scientific | 14-206-62AC22 | |
| Betadine solution | Fisher Scientific | NC1696484 | |
| Buprenorphine | Patterson Vet Supply | 07-892-5235 | Controlled substance |
| Eyelube | Fisher Scientific | 50-218-8442 | |
| Glass syringe | Hamilton | 7634-01 | |
| Injection needle | Hamilton | 7803-01 | 27 gauge, Small Hub RN needle, point style: 4, Needle length: 10cm, Angle: 45 |
| Isoflurane | Patterson Vet Supply | 07-893-8441 | |
| Isoflurane vaporizer | Vet Equip | V-10 | |
| Laboratory Tape | VWR | 89098-128 | |
| Medical grade oxygen | Airgas | OX USPEA | |
| Paraformaldehyde | Millipore-Sigma | 8.18715.1000 | |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | J67802.K2 | |
| PulsaR Software | Open source, University of Otago | See ref 9 | |
| Ruler | Fisher Scientific | 12-00-152 | |
| Silastic tubing (0.040" I.D.) | DOW | 508-005 | |
| Silastic tubing (0.078" I.D.) | DOW | 508-009 | |
| Sterile saline | VWR | 101320-574 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 |
Referências
- Roseweir, A. K., et al. Discovery of potent kisspeptin antagonists delineate physiological mechanisms of gonadotropin regulation. Journal of Neuroscience. 29 (12), 3920-3929 (2009).
- Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. Journal of Visualized Experiments. (91), e51863 (2014).
- Taylor, Z. V., Khand, B., Porgador, A., Monsonego, A., Eremenko, E. An optimized intracerebroventricular injection of CD4(+) T cells into mice. STAR Protocols. 2 (3), 100725 (2021).
- Russo, K. A., et al. Circadian control of the female reproductive axis through gated responsiveness of the RFRP-3 system to VIP signaling. Endocrinology. 156 (7), 2608-2618 (2015).
- Laursen, S. E., Belknap, J. K. Intracerebroventricular injections in mice. Some methodological refinements. Journal of Pharmacological Methods. 16 (4), 355-357 (1986).
- Haley, T. J., McCormick, W. G. Pharmacological effects produced by intracerebral injection of drugs in the conscious mouse. British Journal of Pharmacology and Chemotherapy. 12 (1), 12-15 (1957).
- McCosh, R. B., et al. Insulin-induced hypoglycaemia suppresses pulsatile luteinising hormone secretion and arcuate Kiss1 cell activation in female mice. Journal of Neuroendocrinology. 31 (12), e12813 (2019).
- Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio-Protocol. 11 (5), e3988 (2021).
- Comba, A., et al. Laser capture microdissection of glioma subregions for spatial and molecular characterization of intratumoral heterogeneity, oncostreams, and invasion. Journal of Visual Experiments. (158), e60939 (2020).
- Porteous, R., et al. Reformulation of PULSAR for analysis of pulsatile LH secretion and a revised model of estrogen-negative feedback in mice. Endocrinology. 162 (11), (2021).
- Hohmann, J. G., et al. Differential role of melanocortins in mediating leptin’s central effects on feeding and reproduction. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative, and Comparative Physiology. 278 (1), R50-R59 (2000).
- Gottsch, M. L., et al. A role for kisspeptins in the regulation of gonadotropin secretion in the mouse. Endocrinology. 145 (9), 4073-4077 (2004).
- Krasnow, S. M., et al. A role for galanin-like peptide in the integration of feeding, body weight regulation, and reproduction in the mouse. Endocrinology. 144 (3), 813-822 (2003).
