Her beskrives en etableret metode til at udføre kontraktilitets- og calciummålinger i humant inducerede pluripotente stamcelleafledte kardiomyocytter ved hjælp af en optikbaseret platform. Denne platform gør det muligt for forskere at studere effekten af mutationer og responsen på forskellige stimuli på en hurtig og reproducerbar måde.
Human induceret pluripotent stamcelleafledte kardiomyocytter (hiPSC-CM’er) repræsenterer et kraftfuldt værktøj til at studere mutationsmedierede ændringer i kardiomyocytfunktion og definere virkningerne af stressorer og lægemiddelinterventioner. I denne undersøgelse demonstreres det, at dette optikbaserede system er et kraftfuldt værktøj til at vurdere de funktionelle parametre for hiPSC-CM’er i 2D. Ved at bruge denne platform er det muligt at udføre parrede målinger i et velbevaret temperaturmiljø på forskellige pladelayouter. Desuden giver dette system forskere øjeblikkelig dataanalyse.
Dette papir beskriver en metode til måling af kontraktiliteten af umodificerede hiPSC-CM’er. Kontraktionskinetikken måles ved 37 °C baseret på pixelkorrelationsændringer i forhold til en referenceramme taget ved afslapning ved en 250 Hz samplingfrekvens. Derudover kan samtidige målinger af intracellulære calciumtransienter opnås ved at indlæse cellen med en calciumfølsom fluorofor, såsom Fura-2. Ved hjælp af en hyperswitch kan ratiometriske calciummålinger udføres på et belysningspunkt med en diameter på 50 μm, svarende til arealet af kontraktilitetsmålingerne.
Hjertesvigt er den største dødsårsag på verdensplan. I 2019 forårsagede hjerte-kar-sygdomme 18,6 millioner dødsfald globalt, hvilket afspejler en stigning på 17,1% i løbet af det sidste årti1. På trods af forskernes bestræbelser på at identificere lægemiddelmål for at forebygge og helbrede hjertesvigt er patientresultaterne stadig dårlige2. Forskellen i patofysiologien af dyremodeller med hensyn til mennesker kan være en af de underliggende faktorer i den begrænsede succes for optimering af hjertesvigtsbehandling3. Yderligere menneskelignende modeller er berettiget til at modellere sygdom og teste toksiciteten og effektiviteten af nye lægemiddelforbindelser.
Human inducerede pluripotente stamcelleafledte kardiomyocytter (hiPSC-CM’er) repræsenterer et kraftfuldt værktøj til at definere cellulære patomekanismer induceret af stressorer, iskæmi, ændret metabolisme eller patogene genvarianter og effektiviteten og toksiciteten af lægemiddelinterventioner4. For at definere effekter på hiPSC-CM’ers funktionelle egenskaber er et højhastighedssystem, der måler de systoliske og diastoliske egenskaber af cellulære sammentrækninger på en upartisk og reproducerbar måde, berettiget. Dette overordnede mål med den aktuelle undersøgelse er at demonstrere, at et optikbaseret system er et kraftfuldt værktøj til at udføre realtidsanalyser af de funktionelle parametre for hiPSC-CM’er.
I øjeblikket er der flere platforme til evaluering af kontraktiliteten af hiPSC-CM’er. Imidlertid tilbyder nuværende systemer enten en langsom aflæsning, eller det krævede antal celler kan være en udfordring. Etiketfri videomålingssystemer5,6 er afhængige af post-hoc-analyse af videoer, hvilket kræver meget lagerplads og mangler direkte feedback under videooptagelse. Desuden er det vanskeligt at opnå tilstrækkelig tidsmæssig og rumlig opløsning, og det kan resultere i undersampling. Andre metoder til bestemmelse af kardiomyocytegenskaber, såsom grupperede regelmæssigt interspaced korte palindromiske gentagelser (CRISPR) / Cas9-redigerede hiPSC-CM’er7 med fluorescerende reportere, kan forstyrre cellernes genstabilitet og kræve specialiseret laboratorieekspertise.
For at overvinde de ovennævnte begrænsninger blev et unikt optikbaseret målesystem udviklet og introduceret i denne undersøgelse. Denne platform muliggør kontraktilitetsmålinger på umodificerede hiPSC-CM’er ved blot at genbelægge dem på ethvert påkrævet pladeformat uden nogen begrænsning i pladestørrelse. Desuden muliggør realtidsmålinger direkte observation og analyse af de funktionelle parametre for hiPSC-CM’er og giver derved en eksperimentel indstilling til øjeblikkeligt at justere og optimere protokoller. Desuden gemmes placeringen af hver måling, hvilket muliggør parrede målinger på den samme prøve og derved øger eksperimenternes effekt.
For at demonstrere det optikbaserede system blev kontraktilitetsmålinger udført på en kontrol hiPSC-CM-linje. Denne kontrol hiPSC-linje blev genereret fra dermal fibroblast hos en sund mandlig donor med en normal karyotype8. Kontraktionskinetikken blev målt ved 37 °C baseret på pixelkorrelationsændringer i forhold til en referenceramme taget under afslapning ved en 250 Hz samplingfrekvens. Da den nøjagtige begyndelse af sammentrækningen ikke altid kan bestemmes entydigt, blev det tidspunkt, hvor 20% af tophøjden blev nået (tid til top 20%), taget som udgangspunkt for målinger af tid til top. Ved at gøre dette blev der fundet mindre variabilitet for denne parameter inden for en prøve. Da det nøjagtige tidspunkt, hvor signalet vender tilbage til baseline, er vanskeligt at vurdere, blev den tid, det tog at nå 80% af tilbagevenden til baseline fra peak (tid til baseline 80%) ), brugt til at beskrive afslapningstiden.
Samlede kontraktilitetsmålinger omfattede hvileslagfrekvenser, tiden fra 20% peak til peak kontraktion (TP. Con), og tiden fra peak sammentrækning til 80% af baseline (TB. Con80) (figur 1B). For at teste effekten af en stressor blev celler inkuberet med isoprenaline (ISO). Derudover blev Ca 2+ transienter sammen med kontraktilitetsmålinger målt ved at indlæse cellerne med Fura-2-acetoxymethylester (Fura-2 AM) med en prøveudtagningsfrekvens på 250 Hz. Ratiometriske Ca 2+ målinger 9 ved hjælp af en hyperswitch blev udført på et 50 μm diameter belysningsområde, svarende til arealet af kontraktilitetsmålingerne. Ca 2+ måledata er vist som tiden fra 20% top til top i Ca2+ transient (TP.Ca) og tiden fra top til 80% af baseline (TB.Ca80) (figur 1C). Et hurtigt, automatisk dataanalyseværktøj blev brugt til at give gennemsnitlige kontraktile og calciumkinetiske parametre for hvert område.
I denne undersøgelse beskrives en metode til at udføre kontraktilitets- og calciumtransiente målinger på hiPSC-CM’er og undersøge effekten af stressorer / lægemidler på disse celler. Kontraktilitetsmålinger, ratiometriske calciummålinger og responsen på ISO blev udført på tre forskellige differentieringsrunder som biologiske replikater. For hver biologisk replikat blev der udført målinger på tre brønde, da de tekniske replikaterer. Årsagen til at udføre målingerne på denne måde var at sikre, at den biologiske variabilitet og den tekniske variabilitet af prøven og platformen kunne evalueres. Bortset fra at overveje det passende antal biologiske og tekniske replikater, kan hiPSC-CM-dyrkningstilstanden spille en vigtig rolle for at opnå konstante og robuste resultater. Det er vigtigt at være i overensstemmelse med kriterier, såsom alderen på hiPSC-CM’er, sammensætning af medium, genbelægningsbetingelser og sammensat inkubationstid under målinger. I denne undersøgelse tog det i gennemsnit 568 ± 24 s at måle 11 områder to gange i 10 s i en brønd. Dette inkluderer en ISO-inkubationstid på 79 ± 11 s. Dette kommer ned på ca. 10 minutter pr. Brønd, hvilket skulle gøre det muligt for forskere at måle en fuld 24-brøndplade i ~ 4 timer. Klimakontrollen bruges til at opretholde stabil CO2. Dette gør det muligt at måle effekten af forbindelser/stressorer på hiPSC-CM’er på en højhastighedsmåde.
For at måle kontraktilfunktionen af iPSC-CM’er er der flere eksisterende systemer, der er afhængige af optogenetik13 eller etiketfri videobaseret mikroskopi 5,6. Optogenetiske systemer er ret komplekse og kræver særlige teknikker til at opnå enten elektrofysiske og / eller kontraktilitetsdata. Andre systemer er afhængige af post-hoc-analyse af videoer, hvilket kræver meget lagerplads og mangler direkte feedback under videooptagelse. Desuden er det vanskeligt at opnå tilstrækkelig tidsmæssig og rumlig opløsning, hvilket kan resultere i undersampling. Ligeledes kan CRISPR/CAS-9-redigerede hiPSC-CM’er med fluorescerende reportere7 introducere uønskede virkninger på kardiomyocytadfærd. Brugen af fluorescerende farvestoffer til kontraktionsafslapningsmålinger er også en elegant tilgang, men begrænser udførelsen af eksperimenter på den samme prøve over en længere periode14.
Denne optikbaserede måleplatform kunne dog bruges til måling af sammentræknings-afslapningstider uden brug af fluorescerende farvestof eller invasive metoder. Da pixelkorrelation imidlertid ikke giver geografisk information, kan denne metode ikke bruges til at måle styrken af sammentrækning, men kan kun pålideligt registrere ændringer i hastigheden af sammentrækning og afslapning. Det indførte målesystem er temperaturstyret og kan indsamle calcium- og kontraktilitetsdata i realtid med en opløsning på >200 billeder pr. Sekund. Derudover gemmes placeringen af hver måling, hvilket muliggør parrede målinger og derved øger eksperimenternes effekt. Desuden giver denne platform forskere mulighed for at gemme data og analysere dem øjeblikkeligt efter eksperimentet. Samlet set viser dette optikbaserede målesystem sig at være en lovende metode til at studere cellulære patomekanismer, kan evaluere effekten af forbindelser på funktionaliteten af hiPSC-CM’er og kan være nyttigt med den prækliniske proces i lægemiddelscreening.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskning er delvist finansieret af Eurostars-bevillingen Estars2 113937 CARDIOMYO (EM & DK) og NWO-VICI grant 91818602 (JV).
µ-Plate 24 Well Black ID 14 mm | ibidi | 82421 | |
B-27 Supplement (50x) | Thermo Fisher | 17504044 | |
CytoSolver transient analysis tool | CytoCypher | A fast automatic data analysis tool | |
DMEM/F-12 | Thermo Fisher | 11320033 | |
Fura-2, AM | Thermo Fisher | F1221 | |
Isoprenaline hydrochloride | Merck | 15627 | |
KnockOut™ Serum Replacement | Thermo Fisher | 10828010 | |
Matrigel | Merck | CLS3542C | Basement membrane |
MultiCell CytoCypher with Nikon 20x Super Fluor objective and 730 nm LED light source and Ionwizard software | CytoCypher | Optics-based measurement system | |
ROCK inhibitor Y-27632 | Tocris | 1254 | |
RPMI 1640 | Thermo Fisher | 11875119 | |
Tyrode | Self-made solution with final concentration of the following components: NaCl 134 mM, KCl 5 mM, Hepes 12 mM, MgSO4 1.2 mM, NaH2PO4 H2O 1.2 mM, Glucose 11 mM, Sodium Pyrovate 5 mM, 1 mM CaCl2 |