Isolement de noyaux à partir de cellules progénitrices cardiaques de souris pour le profilage de l’épigénome et de l’expression génique à une résolution unicellulaire
Summary
Nous présentons ici un protocole décrivant la préparation des noyaux cellulaires. Après la microdissection et la dissociation enzymatique du tissu cardiaque en cellules individuelles, les cellules progénitrices ont été congelées, suivies de l’isolement de cellules viables pures, qui ont été utilisées pour le séquençage de l’ARN mononucléaire et le test mononucléique pour la chromatine accessible à la transposase avec des analyses de séquençage à haut débit.
Abstract
Le cœur en développement est une structure complexe contenant diverses cellules progénitrices contrôlées par des mécanismes de régulation complexes. L’examen de l’expression génique et de l’état de chromatine des cellules individuelles permet d’identifier le type et l’état cellulaire. Les approches de séquençage unicellulaire ont révélé un certain nombre de caractéristiques importantes de l’hétérogénéité des cellules progénitrices cardiaques. Cependant, ces méthodes sont généralement limitées aux tissus frais, ce qui limite les études avec diverses conditions expérimentales, car les tissus frais doivent être traités immédiatement dans le même cycle pour réduire la variabilité technique. Par conséquent, des procédures simples et flexibles pour produire des données à partir de méthodes telles que le séquençage de l’ARN mononucléal (snRNA-seq) et le test mononucléal pour la chromatine accessible par transposase avec séquençage à haut débit (snATAC-seq) sont nécessaires dans ce domaine. Ici, nous présentons un protocole pour isoler rapidement les noyaux pour les dual-omiques à noyaux simples suivants (snRNA-seq combiné et snATAC-seq). Cette méthode permet d’isoler des noyaux à partir d’échantillons congelés de cellules progénitrices cardiaques et peut être combinée avec des plates-formes utilisant des chambres microfluidiques.
Introduction
Parmi les malformations congénitales, les cardiopathies congénitales (CHD) sont les plus fréquentes, survenant dans environ 1% des naissances vivantes chaque année 1,2. Les mutations génétiques ne sont identifiées que dans une minorité de cas, ce qui implique que d’autres causes, telles que des anomalies dans la régulation des gènes, sont impliquées dans l’étiologie de la coronaropathie 2,3. Le développement cardiaque est un processus complexe de types cellulaires divers et en interaction, ce qui rend difficile l’identification des mutations causales non codantes et de leurs effets sur la régulation des gènes. L’organogenèse du cœur commence par des progéniteurs cellulaires qui donnent naissance à différents sous-types de cellules cardiaques, notamment les cellules myocardiques, fibroblastiques, épicardiques et endocardiques 4,5. La génomique unicellulaire est en train de devenir une méthode clé pour étudier le développement cardiaque et évaluer l’impact de l’hétérogénéité cellulaire sur la santé et la maladie6. Le développement de méthodes multi-omiques pour la mesure simultanée de différents paramètres et l’expansion des pipelines de calcul a facilité la découverte de types et de sous-types cellulaires dans le cœur normal et malade6. Cet article décrit un protocole fiable d’isolement mononucléaire pour les cellules progénitrices cardiaques congelées obtenues à partir d’embryons de souris qui est compatible avec le snRNA-seq et le snATAC-seq en aval (ainsi qu’avec snRNA-seq et snATAC-seq combinés)7,8,9.
ATAC-seq est une méthode robuste qui permet l’identification des régions chromatiques ouvertes régulatrices et le positionnement des nucléosomes10,11. Cette information est utilisée pour tirer des conclusions sur l’emplacement, l’identité et l’activité des facteurs de transcription. L’activité des facteurs de chromatine, y compris les remodeurs, ainsi que l’activité transcriptionnelle de l’ARN polymérase, peuvent donc être analysées car la méthode est très sensible pour mesurer les changements quantitatifs de la structure de la chromatine 1,2. Ainsi, ATAC-seq fournit une approche robuste et impartiale pour découvrir les mécanismes contrôlant la régulation transcriptionnelle dans un type de cellule spécifique. Les protocoles ATAC-seq ont également été validés pour mesurer l’accessibilité de la chromatine dans des cellules individuelles, révélant une variabilité dans l’architecture de la chromatine au sein des populations cellulaires10,12,13.
Bien qu’il y ait eu des progrès notables dans le domaine des cellules individuelles ces dernières années, la principale difficulté est le traitement des échantillons frais nécessaires à la réalisation de ces expériences14. Pour contourner cette difficulté, divers tests ont été réalisés dans le but de réaliser des analyses telles que snRNA-seq et snATAC-seq avec du tissu cardiaque congelé ou des cellules15,16.
Plusieurs plateformes ont été utilisées pour analyser les données génomiques unicellulaires17. Les plateformes largement utilisées pour l’expression génique unicellulaire et le profilage ATAC sont des plateformes pour l’encapsulation de gouttelettes microfluidiques multiples17. Comme ces plates-formes utilisent des chambres microfluidiques, les débris ou les agrégats peuvent obstruer le système, ce qui rend les données inutilisables. Ainsi, le succès des études unicellulaires dépend de l’isolement précis des cellules/noyaux individuels.
Le protocole présenté ici utilise une approche similaire aux études récentes utilisant snRNA-seq et snATAC-seq pour comprendre les malformations cardiaques congénitales 18,19,20,21,22,23. Cette procédure utilise la dissociation enzymatique de tissus cardiaques fraîchement microdisséqués suivie de la cryoconservation de cellules progénitrices cardiaques de souris. Après décongélation, les cellules viables sont purifiées et traitées pour l’isolement nucléaire. Dans ce travail, ce protocole a été utilisé avec succès pour obtenir des données snRNA-seq et snATAC-seq à partir de la même préparation nucléaire de cellules progénitrices cardiaques de souris.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’analyse de la composition cellulaire du cœur en développement par des études combinées snRNA-seq et snATAC-seq permet de mieux comprendre l’origine des cardiopathies congénitales26. Plusieurs laboratoires de recherche ont étudié les effets de la cryoconservation des tissus cardiaques sur le snRNA-seq27. La réalisation de snRNA-seq et de snATAC-seq à l’aide de tissus micro-disséqués frais provenant de modèles murins de maladie humaine peut être difficile…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été soutenue par ERA-CVD-2019 et ANR-JCJC-2020 à SS. Nous remercions l’installation de génomique et de bioinformatique (GBiM) du laboratoire U 1251/Marseille Medical Genetics et les examinateurs anonymes pour leurs précieux commentaires.
Materials
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | No catalog number | |
| 5M Sodium chloride (NaCl) | Sigma | 59222C-500ML | |
| BSA 10% | Sigma | A1595-50ML | |
| Chromium Next GEM Chip J Single Cell Kit, 16 rxns | 10X Genomics | 1000230 | |
| Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 4 rxns (including Nuclei Buffer 20X) | 10X Genomics | 1000285 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
| Countess III FL | Thermofisher | No catalog number | |
| Digitonin (5%) | Thermofisher | BN2006 | |
| DMSO | Sigma | D2650-5x5ML | |
| DNA LoBind Tubes | Eppendorf | 22431021 | |
| D-PBS | Thermofisher | 14190094 | Sterile and RNase-free |
| Dual Index Kit TT Set A 96 rxns | 10X Genomics | 1000215 | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 352096 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 10788561 | |
| HI-FBS | Thermofisher | A3840001 | Heat inactivated |
| High sensitivity DNA kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Igepal CA-630 | Sigma | I8896-50ML | |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Thermofisher | L3224 | |
| MACS Dead Cell Removal kit: Dead Cell Romoval MicroBeads, Binding Buffer 20X | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| MACS SmartStrainers (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma | M1028-100ML | |
| Milieu McCoy 5A | Thermofisher | 16600082 | |
| MS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| NovaSeq 6000 S2 | Illumina | No catalog number | |
| Penicillin Streptomycin (Pen/Strep) | Thermofisher | 15070063 | |
| PluriStrainer Mini 40µm | PluriSelect | V-PM15-2021-12 | |
| Rock inhibitor | Enzo Life Sciences | ALX-270-333-M005 | |
| Single Index Kit N Set A, 96 rxn | 10X Genomics | 1000212 | |
| Standard 90mm Petri dish Sterilin | Thermofisher | 101R20 | |
| Sterile double-distilled water | Thermofisher | R0582 | |
| Trizma Hydrochloride solution (HCl) | Sigma | T2194-100ML | |
| Trypan Blue stain (0.4%) | Invitrogen | T10282 | |
| Trypsin 0.05% – EDTA 1X | Thermofisher | 25300054 | |
| Tween20 | Sigma | P9416-50ML | |
| Wide orifice filtered pipette tips 200 μl | Labcon | 1152-965-008-9 | |
| ZEISS SteREO Discovery.V8 | ZEISS | No catalog number |
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