Etablering af blandede neuronale og gliacellekulturer fra embryonale musehjerner for at studere infektion og medfødt immunitet
Summary
Denne protokol præsenterer en unik måde at generere cellekulturer i centralnervesystemet fra embryonale dag 17 musehjerner til neuro(immun)logikforskning. Denne model kan analyseres ved hjælp af forskellige eksperimentelle teknikker, herunder RT-qPCR, mikroskopi, ELISA og flowcytometri.
Abstract
Modeller af centralnervesystemet (CNS) skal rekapitulere det komplekse netværk af sammenkoblede celler, der findes in vivo. CNS består primært af neuroner, astrocytter, oligodendrocytter og mikroglia. På grund af den stigende indsats for at erstatte og reducere brugen af dyr er der udviklet en række de vitro-cellekultursystemer for at udforske medfødte celleegenskaber, som muliggør udvikling af lægemidler til CNS-infektioner og patologier. Mens visse forskningsspørgsmål kan løses af menneskebaserede cellekultursystemer, såsom (inducerede) pluripotente stamceller, har arbejdet med humane celler sine egne begrænsninger med hensyn til tilgængelighed, omkostninger og etik. Her beskriver vi en unik protokol til isolering og dyrkning af celler fra embryonale musehjerner. De resulterende blandede neurale cellekulturer efterligner flere cellepopulationer og interaktioner, der findes i hjernen in vivo. Sammenlignet med de nuværende ækvivalente metoder efterligner denne protokol hjernens egenskaber og samler også flere celler, hvilket gør det muligt at undersøge flere eksperimentelle tilstande fra en gravid mus. Desuden er protokollen relativt let og meget reproducerbar. Disse kulturer er optimeret til brug i forskellige skalaer, herunder 96-brøndbaserede skærme med høj kapacitet, 24-brønds mikroskopianalyse og 6-brøndkulturer til flowcytometri og revers transkriptionskvantitativ polymerasekædereaktion (RT-qPCR) analyse. Denne kulturmetode er et kraftfuldt værktøj til at undersøge infektion og immunitet inden for rammerne af nogle af kompleksiteten af CNS med bekvemmeligheden ved in vitro-metoder .
Introduction
Forbedring af vores forståelse af centralnervesystemet (CNS) er afgørende for at forbedre terapeutiske muligheder for mange neuroinflammatoriske og neurodegenerative sygdomme. CNS, et komplekst netværk af sammenkoblede celler i hjernen, rygmarven og synsnerverne, omfatter neuroner, oligodendrocytter, astrocytter og deres medfødte immunceller, microglia1. En in vitro-tilgang kan ofte drastisk reducere antallet af mus, der kræves for at udføre meningsfuld forskning; CNS’s komplekse karakter gør det imidlertid umuligt at rekapitulere in vivo-situationen ved hjælp af cellelinjer. Blandede neurale cellekulturer giver et ekstremt værdifuldt forskningsværktøj til at undersøge neuro(immun)logiske spørgsmål i en relevant model i overensstemmelse med principperne om udskiftning, reduktion og forfining (3R) 2,3.
Thomson et al. beskrev en cellekulturmetode ved hjælp af prænatale rygmarvsceller, der differentierer sig til alle de førnævnte vigtigste CNS-celletyper4. Dette system har også synapsedannelse, myelinerede axoner og knudepunkter af Ranvier. Hovedbegrænsningen ved denne dyrkningsmetode er, at den ikke med fordel modellerer hjernen, da den er rygmarv, og celleudbyttet fra embryonal dag 13 (E13) rygmarv trækker sig sammen. Dette begrænser således antallet af eksperimentelle forhold, der kan undersøges. Derfor havde denne undersøgelse til formål at udvikle et nyt cellekultursystem, der rekapitulerer hjernens egenskaber med øget celleudbytte for at reducere kravene til dyr.
Med udgangspunkt i Thomson et al. udviklede vi en cellekulturmodel, der udelukkende stammer fra prænatale musehjerner. Disse kulturer har de samme cellepopulationer, sammenkobling og behandlingsmuligheder som rygmarvskulturerne, bortset fra at der er mindre myelinering ved sammenligning. Imidlertid er det mere effektivt at have en CNS in vitro-model med et cirka tre gange højere celleudbytte, hvilket kræver færre mus og mindre tid til behandling af embryoner. Vi optimerede dette unikke dyrkningssystem til flere downstream-applikationer og vægte, herunder brug af glasdæksler til mikroskopianalyse og forskellige størrelser af plastbrøndplader, herunder 96-brøndsplader til forskning med høj kapacitet.
Protocol
Representative Results
Discussion
CNS er et komplekst netværk, der spænder fra hjernen ned til rygmarven og består af mange celletyper, overvejende neuroner, oligodendrocytter, astrocytter og microglia1. Da hver celle har en vigtig rolle i at opretholde homeostase og generere passende svar på udfordringer i CNS 9,10,11, er et dyrkningssystem, der indeholder alle disse celletyper, et nyttigt og alsidigt værktøj til at undersøge, hvordan hjerne…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke medlemmer af Edgar og Linington laboratorier, især Prof. Chris Linington, Dr. Diana Arseni og Dr. Katja Muecklisch, for deres råd, nyttige kommentarer og hjælp til at fodre kulturerne, mens vi opretter disse kulturer. En særlig tak til Dr. Muecklisch for at have givet startpunkterne for Cell Profiler-rørledningerne. Dette arbejde blev støttet af MS Society (bevilling 122) og Yuri og Lorna Chernajovsky Foundation til MP; University of Glasgow finansiering til JC og MP; og Wellcome Trust (217093/Z/19/Z) og Medical Research Council (MRV0109721) til GJG.
Materials
| 10x Trypsin | Sigma | T4549-100ML | To digest tissue |
| 140 mm TC Dish | Fisher | 11339283 | Put 8 35 mm dishes per 1 140 mm dish |
| 15 mL Falcon | Sarstedt | 62554502 | To collect cells into pellet for resuspension in plating media |
| 18 G needle | Henke Sass Wolf | 4710012040 | For trituration of sample |
| 21 G needle | BD | 304432 | For trituration of sample |
| 23 G needle | Henke Sass Wolf | 4710006030 | For trituration of sample |
| 35 mm TC Dish | Corning | 430165 | Plate out 3 PLL coated coverslips per 1 35 mm dish |
| 5 mL syringe | Fisher | 15869152 | For trituration of sample |
| 6 well plate | Corning | 3516 | To plate out cells for RT-qPCR, and flow cytometry |
| 7 mL Bijoux | Fisher | DIS080010R | To put brains intp |
| 96 well plate | Corning | 3596 | To plate out cells for high-throughput testing |
| ACSA-2 Antibody, anti-mouse, PE | Miltenyi | 130-123-284 | For flow cytometry staining of astrocytes |
| Angled forceps | Dumont | 0108-5/45-PO | For dissection |
| Biotin | Sigma | B4501 | For DM+/- |
| Boric Acid | Sigma | B6768-500G | For boric acid buffer |
| Brilliant Violet 421 anti-mouse CD24 Antibody, clone M1-69 | Biolegend | 101825 | For flow cytometry staining of neurons and astrocytes |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD45 Antibody, clone 30-F11 | Biolegend | 103139 | For flow cytometry staining of microglia |
| Brilliant Violet 785 anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70 | Biolegend | 101243 | For flow cytometry staining of microglia |
| BSA Fraction V | Sigma | A3059-10G | For SD Inhibitor |
| CNP | Abcam | AB6319 | Mature oligodendrocytes |
| Coverslip | VWR | 631-0149 | To plate out cells for microscopy |
| Dissection Scissors | Sigma | S3146-1EA | For dissection |
| DMEM High glucose, sodium pyruvate, L-Glutamine | Gibco | 21969-035 | For DM+/-, and for plating media |
| DNase I | Thermofisher | 18047019 | For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from sigma |
| DNase I | Sigma | D4263 | For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from thermofisher |
| eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 | Thermofisher | 65-0865-14 | Live / Dead stain |
| Fine forceps | Dumont | 0102-SS135-PO | For dissection |
| GFAP | Invitrogen | 13-0300 | Astrocytes |
| HBSS w Ca Mg | Sigma | H9269-500ML | For plating media |
| HBSS w/o Ca Mg | Sigma | H9394-500ML | For brains to be added to |
| Horse Serum | Gibco | 26050-070 | For plating media |
| Hydrocortisone | Sigma | H0396 | For DM+/- |
| Iba1 | Alpha-Laboratories | 019-1971 | Microglia |
| Insulin | Sigma | I1882 | For DM+ |
| Leibovitz L-15 | GIbco | 11415-049 | For SD Inhibitor |
| MBP | Bio-Rad | MCA409S | Myelin |
| Mouse CCL5/RANTES DuoSet ELISA Kit | BioTechne | DY478-05 | ELISA kit for quantifying concentration of CCL5 in supernatants of 96 well plate |
| N1 media supplement | Sigma | N6530-5ML | For DM+/- |
| Nestin | Merck | MAB353 | Neuronal stem/progenitor cells |
| NeuN | Thermofisher | PA578499 | Neuronal cell body |
| NG2 | Sigma | AB5320 | Immature oligodendrocytes |
| O4 Antibody, anti-human/mouse/rat, APC | Miltenyi | 130-119-155 | For flow cytometry staining of oligodendrocytes |
| Pen/Strep | Sigma | P0781-100ML | For DM+/-, and for plating media |
| Poly-L-Lysinehydrobromide | Sigma | P1274 | For Boric acid / poly-L-lysine solution to coat coverslips |
| SMI31 | BioLegend | 801601 | Axons |
| Sodium Tetraborate | Sigma | 221732-100G | For boric acid buffer |
| Trizol | Thermofisher | 15596026 | For lysing cells for RT-qPCR |
| Trypsin inhibitor from soybean | Sigma | T9003-100MG | For SD Inhibitor |
Referências
- Kovacs, G. G. Cellular reactions of the central nervous system. Handbook of Clinical Neurology. 145, 13-23 (2018).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. . The Principles of Humane Experimental Techniques. 1, (1959).
- Hubrecht, R. C., Carter, E. The 3Rs and humane experimental technique: Implementing change. Animals. 9 (10), 754 (2019).
- Thomson, C. E., et al. synapsing cultures of murine spinal cord-validation as an in vitro model of the central nervous system. The European Journal of Neuroscience. 28 (8), 1518-1535 (2008).
- Bijland, S., et al. An in vitro model for studying CNS white matter: Functional properties and experimental approaches. F1000Research. 8, 117 (2019).
- Fragkoudis, R., et al. Neurons and oligodendrocytes in the mouse brain differ in their ability to replicate Semliki Forest virus. Journal of Neurovirology. 15 (1), 57-70 (2009).
- Hayden, L., et al. Lipid-specific IgMs induce antiviral responses in the CNS: Implications for progressive multifocal leukoencephalopathy in multiple sclerosis. Acta Neuropathologica Communications. 8 (1), 135 (2020).
- Kantzer, C. G., et al. Anti-ACSA-2 defines a novel monoclonal antibody for prospective isolation of living neonatal and adult astrocytes. Glia. 65 (6), 990-1004 (2017).
- Yin, J., Valin, K. L., Dixon, M. L., Leavenworth, J. W. The role of microglia and macrophages in CNS homeostasis, autoimmunity, and cancer. Journal of Immunology Research. 2017, (2017).
- Gee, J. R., Keller, J. N. Astrocytes: Regulation of brain homeostasis via apolipoprotein E. The International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 37 (6), 1145-1150 (2005).
- Madeira, M. M., Hage, Z., Tsirka, S. E. Beyond myelination: possible roles of the immune proteasome in oligodendroglial homeostasis and dysfunction. Frontiers in Neuroscience. 16, 867357 (2022).
- Keller, D., Erö, C., Markram, H. Cell densities in the mouse brain: A systematic review. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 83 (2018).
- Wang, Y. X., et al. Oxygenglucose deprivation enhancement of cell death/apoptosis in PC12 cells and hippocampal neurons correlates with changes in neuronal excitatory amino acid neurotransmitter signaling and potassium currents. Neuroreport. 27 (8), 617-626 (2016).
- Rock, K. L., Kono, H. The inflammatory response to cell death. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 3, 99-126 (2008).
- Chen, V. S., et al. Histology atlas of the developing prenatal and postnatal mouse central nervous system, with emphasis on prenatal days E7.5 to E18.5. Toxicologic Pathology. 45 (6), 705-744 (2017).
- Gordon, J., Amini, S., White, M. K. General overview of neuronal cell culture. Methods in Molecular Biology. 1078, 1-8 (2013).
- Kesselheim, A. S., Hwang, T. J., Franklin, J. M. Two decades of new drug development for central nervous system disorders. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (12), 815-816 (2015).
- Gribkoff, V. K., Kaczmarek, L. K. The need for new approaches in CNS drug discovery: Why drugs have failed, and what can be done to improve outcomes. Neuropharmacology. 120, 11-19 (2017).
- Zamanian, J. L., et al. Genomic analysis of reactive astrogliosis. Journal of Neuroscience. 32 (18), 6391-6410 (2012).
- Nishiyama, A., Suzuki, R., Zhu, X. NG2 cells (polydendrocytes) in brain physiology and repair. Frontiers in Neuroscience. 8, 133 (2014).
- Lee, C. T., Bendriem, R. M., Wu, W. W., Shen, R. F. 3D brain organoids derived from pluripotent stem cells: Promising experimental models for brain development and neurodegenerative disorders. Journal of Biomedical Science. 24 (1), 59 (2017).
- Asch, B. B., Medina, D., Brinkley, B. R. Microtubules and actin-containing filaments of normal, preneoplastic, and neoplastic mouse mammary epithelial cells. Pesquisa do Câncer. 39 (3), 893-907 (1979).
- Koch, K. S., Leffertt, H. L. Growth control of differentiated adult rat hepatocytes in primary culture. Annals of the New York Academy of Sciences. 349, 111-127 (1980).
- Nevalainen, T., Autio, A., Hurme, M. Composition of the infiltrating immune cells in the brain of healthy individuals: effect of aging. Immunity and Ageing. 19 (1), 45 (2022).
- Daneman, R., Prat, A. The blood-brain barrier. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (1), 020412 (2015).
