פרוטוקול בדיקת גזירה לקביעת תכונות חומר חד-תאי
Summary
פרוטוקול זה מתאר את כימות התכונות המכניות של קווי תאים סרטניים ולא סרטניים במבחנה. הבדלים שמורים במכניקה של תאים סרטניים ונורמליים יכולים לשמש כסמן ביולוגי שעשוי להיות בעל השלכות על הפרוגנוזה והאבחנה.
Abstract
ביומכניקה לא סדירה היא סימן ההיכר של ביולוגיה של סרטן הנתונה למחקר מקיף. התכונות המכניות של תא דומות לאלה של חומר. עמידותו של התא בפני לחץ ומתח, זמן ההרפיה שלו וגמישותו הם כולם תכונות שניתן להפיק ולהשוות לסוגים אחרים של תאים. כימות התכונות המכניות של תאים סרטניים (ממאירים) לעומת תאים נורמליים (לא ממאירים) מאפשר לחוקרים להמשיך ולחשוף את היסודות הביופיזיקליים של מחלה זו. בעוד התכונות המכניות של תאים סרטניים ידועות כשונות באופן עקבי מהתכונות המכניות של תאים נורמליים, הליך ניסיוני סטנדרטי כדי להסיק תכונות אלה מתאים בתרבית לוקה בחסר.
מאמר זה מתאר הליך לכימות התכונות המכניות של תאים בודדים במבחנה באמצעות בדיקת גזירה נוזלית. העיקרון מאחורי בדיקה זו כרוך בהפעלת לחץ גזירה נוזלי על תא בודד וניטור אופטי של העיוות התאי שנוצר לאורך זמן. תכונות מכניות של תאים מאופיינות לאחר מכן באמצעות ניתוח מתאם תמונה דיגיטלית (DIC) והתאמת מודל ויסקו-אלסטי מתאים לנתונים הניסיוניים המופקים מניתוח DIC. בסך הכל, הפרוטוקול המתואר כאן נועד לספק שיטה יעילה וממוקדת יותר לאבחון של סוגי סרטן קשים לטיפול.
Introduction
חקר ההבדלים הביופיזיים בין תאים סרטניים ולא-סרטניים מאפשר הזדמנויות אבחוניות וטיפוליות חדשות1. הבנת האופן שבו הבדלים בביומכניקה/מכנוביולוגיה תורמים להתקדמות הגידול ולעמידות לטיפול תחשוף דרכים חדשות לטיפול ממוקד ואבחון מוקדם2.
בעוד שידוע כי תכונות מכניות של תאים סרטניים שונות מתאים נורמליים (למשל, צמיגות קרום הפלזמה והמעטפת הגרעינית)3,4,5, חסרות שיטות חזקות וניתנות לשחזור למדידת תכונות אלה בתאים חיים6. שיטת בדיקת הגזירה משמשת לכימות התכונות המכניות של תאים על ידי חשיפת תאים בודדים ללחץ גזירה נוזלי וניתוח תגובותיהם האישיות והתנגדותם ללחץ המופעל 3,4,5,7,8,9. למרות שמספר שיטות וטכניקות שימשו לאפיון התכונות המכניות של תאים בודדים, אלה נוטות להשפיע על תכונות חומר התא על ידי i) ניקוב/פגיעה בקרום התא עקב עומק הכניסה, גיאומטריות קצה מורכבות, או הקשחת מצע הקשורים למיקרוסקופ כוח אטומי (AFM)10,11, ii) גרימת נזק לאור תאי במהלך לכידה אופטית 12, 13, או iii) גרימת מצבי לחץ מורכבים הקשורים לשאיפת מיקרופיפטה14,15. השפעות חיצוניות אלה קשורות לאי-ודאות משמעותית בדיוק מדידות צמיגות התא 6,16,17.
כדי להתמודד עם מגבלות אלה, שיטת בדיקת הגזירה המתוארת כאן מספקת גישה מאוד נשלטת ופשוטה להדמיית זרימה פיזיולוגית בגוף מבלי להשפיע על תכונות החומר התאי בתהליך. לחצים לגזירת נוזלים בבדיקה זו מייצגים לחצים מכניים שחווים תאים בגוף או על ידי נוזלים בתוך אינטרסטיציום הגידול או בדם במהלך מחזורהדם 18,19,20. יתר על כן, לחצים נוזליים אלה מקדמים התנהגויות ממאירות שונות בתאים סרטניים, כולל התקדמות, נדידה, גרורות ומוות תאי 19,21,22,23 המשתנים בין תאים גידוליים ולא גידוליים. יתר על כן, התכונות המכניות המשתנות של תאים סרטניים (כלומר, הם לעתים קרובות “רכים” יותר מתאים נורמליים הנמצאים באותו איבר) מאפשרות להם להתמיד במיקרו-סביבות גידול עוינות, לפלוש לרקמות נורמליות הסובבות אותם, ולשלוח גרורות לאתרים מרוחקים24,25,26. על ידי יצירת סביבה פסאודו-ביולוגית שבה תאים חווים רמות פיזיולוגיות של עקה גזירה נוזלית, מושג תהליך שהוא רלוונטי פיזיולוגית ולא הרסני לתא. התגובות התאיות ללחצים אלה של גזירת נוזלים מאפשרות לנו לאפיין תכונות מכניות של תאים.
מאמר זה מספק פרוטוקול בדיקת גזירה למחקר מקיף של התכונות המכניות וההתנהגות של תאים סרטניים ולא סרטניים תחת לחץ גזירה מופעל. תאים מגיבים לכוחות חיצוניים בצורה אלסטית וצמיגית ולכן ניתן להפוך אותם לחומר ויסקו-אלסטי3. טכניקה זו מסווגת ל: (i) תרבית תאים של תאים בודדים מפוזרים, (ii) יישום מבוקר של לחץ גזירה נוזלי, (iii) הדמיה באתרו ותצפית על התנהגות התא (כולל עמידות ללחץ ועיוות), (iv) ניתוח מאמץ של תאים כדי לקבוע את מידת העיוות, ו (v) אפיון התכונות הוויסקו-אלסטיות של תאים בודדים. על ידי חקירת התכונות וההתנהגויות המכניות האלה, ניתן לזקק מכנוביולוגיה תאית מורכבת לנתונים הניתנים לכימות. פרוטוקול המתווה שיטה זו מאפשר קיטלוג והשוואה בין סוגי תאים ממאירים ולא ממאירים שונים. לכימות הבדלים אלה יש פוטנציאל לבסס סמנים ביולוגיים אבחוניים וטיפוליים.
Protocol
Representative Results
Discussion
שיטת בדיקת הגזירה, הכוללת הקמת סביבה פסאודו-מכנוביולוגית המדמה את האינטראקציה של תאים עם המיקרו-סביבה המכנית הסובבת אותם ואת תגובותיהם לעקות מכניות, יצרה קטלוג של תכונות מכניות תאיות, שדפוסיהן מראים אטיפיה פיזית שמורה בין שורות תאים סרטניים 3,4,5,7,8 <sup …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לחוקרים קודמים מקבוצת סובוייג’ו במכון הפוליטכני של וורצ’סטר שהיו החלוצים הראשונים בטכניקה זו: ד”ר ייפאנג קאו, ג’ינגג’יה הו וונסה אוזונוואן. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לסרטן (NIH/NCI K22 CA258410 ל-M.D). דמויות נוצרו עם BioRender.com.
Materials
| CELL CULTURE | |||
| .25% Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1x[-] sodium bicarbonate | Corning | 25-053-ci | For cellular detachment from substrate in cell culture |
| 15 mL centrifuge tubes | Falcon by Corning | 05-527-90 | |
| 35 mm Petri dishes | Corning | 430165 | |
| 50 mL centrifuge tubes | Falcon by Corning | 14-432-22 | |
| centrifuge | any | For sterile cell culture | |
| Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM) 1x | Corning | 10-013-cv | Or any other media for culturing cells. DMEM was used for culturing U87 cells |
| gloves | any | For sterile cell culture | |
| Heracell Vios 160i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51033770 | For Incubation during cell culture |
| Hood | any | For sterile cell culture | |
| micropipette | any | For sterile cell culture | |
| micropipette tips | any | For sterile cell culture | |
| Microscope | Leica/any | For sterile cell culture | |
| Phosphate Buffered Saline without calcium and magnesium PBS, 1x | Corning | 21-040-CM | |
| pipetman | any | For sterile cell culture | |
| pipette tips | any | For sterile cell culture | |
| Precision GP 10 liquid incubator | Thermo Scientific | TSGP02 | |
| T25 flask | Corning | 430639 | |
| T75 flask | Corning | 430641U | |
| SHEAR ASSAY | |||
| 100 mL beaker | any | For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media | |
| DMEM | Corning | ||
| Flow chamber + rubber gasket | Glycotech | 31-001 | Circular Flow chamber Kit ( for 35 mm tissue culture dishes) |
| Hybrid Rheometer | HR-2 Discovery Hybrid Rheometer | For determination of shear fluid viscosity | |
| magnetic stir bar | any | For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media | |
| magnetic stir plate | any | For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media | |
| methyl cellulose | any | To increase viscosity of DMEM in flow media | |
| Syringe Pump | KD Scientific Geminin 88 plus | 788088 | For programming fluid infusion and withdrawal |
| syringes, tubing, and connectors | For shear apparatus setup | ||
| SOFTWARE | |||
| ABAQUS software | Simulia | ||
| Digitial Image Correlation software | LaVision, Germany | DAVIS 10.1.2 | |
| Imaging software | Leica/any microscope software | ||
| MATLAB | MATLAB | MATLAB_R2020B |
Referências
- Sethi, S., Ali, S., Philip, P. A., Sarkar, F. H. Clinical advances in molecular biomarkers for cancer diagnosis and therapy. International Journal of Molecular Sciences. 14 (7), 14771-14784 (2013).
- Runel, G., Lopez-Ramirez, N., Chlasta, J., Masse, I. Biomechanical properties of cancer cells. Cells. 10 (4), 887 (2021).
- Hu, J., Zhou, Y., Obayemi, J. D., Du, J., Soboyejo, W. O. An investigation of the viscoelastic properties and the actin cytoskeletal structure of triple negative breast cancer cells. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 86, 1-13 (2018).
- Onwudiwe, K., et al. Investigation of creep properties and the cytoskeletal structures of non-tumorigenic breast cells and triple-negative breast cancer cells. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 110 (5), 1004-1020 (2022).
- Ani, C. J., et al. A shear assay study of single normal/breast cancer cell deformation and detachment from poly-di-methyl-siloxane (PDMS) surfaces. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 91, 76-90 (2019).
- Suresh, S. Biomechanics and biophysics of cancer cells. Acta Biomaterialia. 3 (4), 413-438 (2007).
- Cao, Y., et al. Investigation of the viscoelasticity of human osteosarcoma cells using a shear assay method. Journal of Materials Research. 21 (8), 1922-1930 (2006).
- Cao, Y. On the measurement of human osteosarcoma cell elastic modulus using shear assay experiments. Journal of Materials Science. Materials in Medicine. 18 (1), 103-109 (2007).
- Onwudiwe, K., et al. Actin cytoskeletal structure and the statistical variations of the mechanical properties of non-tumorigenic breast and triple-negative breast cancer cells. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 119, 104505 (2021).
- Kirmizis, D., Logothetidis, S. Atomic force microscopy probing in the measurement of cell mechanics. International Journal of Nanomedicine. 5, 137-145 (2010).
- Haase, K., Pelling, A. E. Investigating cell mechanics with atomic force microscopy. Journal of the Royal Society. Interface. 12 (104), 20140970 (2015).
- Zhang, H., Liu, K. K. Optical tweezers for single cells. Journal of the Royal Society. Interface. 5 (24), 671-690 (2008).
- Peterman, E. J. G., Gittes, F., Schmidt, C. F. Laser-induced heating in optical traps. Biophysical Journal. 84, 1308-1316 (2003).
- Hochmuth, R. M. Micropipette aspiration of living cells. Journal of Biomechanics. 33 (1), 15-22 (2000).
- Evans, E., Yeung, A. Apparent viscosity and corticcal tension of blood granulocytes determined by micropipet aspiration. Biophysical Journal. 56 (1), 151-160 (1989).
- Van Vliet, K. J., Bao, G., Suresh, S. The biomechanics toolbox: experimental approaches for living cells and biomolecules. Acta Materialia. 51 (19), 5881-5905 (2003).
- Moeendarbary, E., Harris, A. R. Cell mechanics: principles, practices, and prospects. Wiley Interdisciplinary Reviews. Systems Biology and Medicine. 6 (5), 371-388 (2014).
- Choi, H. Y., et al. Hydrodynamic shear stress promotes epithelial-mesenchymal transition by downregulating ERK and GSK3beta activities. Breast Cancer Research. 21 (1), 6 (2019).
- Northcott, J. M., Dean, I. S., Mouw, J. K., Weaver, V. M. Feeling stress: The mechanics of cancer progression and aggression. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 17 (2018).
- Onwudiwe, K., Najera, J., Siri, S., Datta, M. Do tumor mechanical stresses promote cancer immune escape. Cells. 11 (23), 3840 (2022).
- Heldin, C. H., Rubin, K., Pietras, K., Ostman, A. High interstitial fluid pressure – an obstacle in cancer therapy. Nature Reviews. Cancer. 4 (10), 806-813 (2004).
- Krog, B. L., Henry, M. D. Biomechanics of the circulating tumor cell microenvironment. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1092, 209-233 (2018).
- Moose, D. L., et al. Cancer cells resist mechanical destruction in circulation via RhoA/actomyosin-dependent mechano-adaptation. Cell Reports. 30 (11), 3864-3874 (2020).
- Mao, B. H., Nguyen Thi, K. M., Tang, M. J., Kamm, R. D., Tu, T. Y. The interface stiffness and topographic feature dictate interfacial invasiveness of cancer spheroids. Biofabrication. 15 (1), (2023).
- Kashani, A. S., Packirisamy, M. Cancer cells optimize elasticity for efficient migration. Royal Society Open Science. 7 (10), 200747 (2020).
- Riehl, B. D., Kim, E., Bouzid, T., Lim, J. Y. The role of microenvironmental cues and mechanical loading milieus in breast cancer cell progression and metastasis. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 608526 (2021).
