Detecção de Mitofagia em Caenorhabditis elegans e Células de Mamíferos Usando Corantes Organel-Específicos

Vijigisha Srivastava; Einav Gross

doi:10.3791/65337

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Artigo de método

Detecção de Mitofagia em Caenorhabditis elegans e Células de Mamíferos Usando Corantes Organel-Específicos

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DOI:

10.3791/65337

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19 de maio de 2023

Vijigisha Srivastava¹ , Einav Gross¹

¹Department of Biochemistry and Molecular Biology, Faculty of Medicine, Institute for Medical Research, Israel-Canada (IMRIC), The Hebrew University of Jerusalem

Neste artigo

Resumo

Explorar a mitofagia por meio de microscopia eletrônica, sensores genéticos e imunofluorescência requer equipamentos caros, pessoal qualificado e um investimento de tempo significativo. Aqui, demonstramos a eficácia de um kit comercial de corante de fluorescência na quantificação do processo de mitofagia em ambos Caenorhabditis elegans e uma linhagem celular de câncer de fígado.

Resumo

As mitocôndrias são essenciais para várias funções biológicas, incluindo produção de energia, metabolismo lipídico, homeostase do cálcio, biossíntese do heme, morte celular regulada e geração de espécies reativas de oxigênio (EROs). As ROS são vitais para os principais processos biológicos. No entanto, quando não controladas, podem levar a lesões oxidativas, incluindo danos mitocondriais. As mitocôndrias danificadas liberam mais EROs, intensificando assim a lesão celular e o estado da doença. Um processo homeostático chamado autofagia mitocondrial (mitofagia) remove seletivamente as mitocôndrias danificadas, que são então substituídas por novas. Existem múltiplas vias de mitofagia, com o objetivo comum sendo a quebra das mitocôndrias danificadas nos lisossomos.

Várias metodologias, incluindo sensores genéticos, imunofluorescência de anticorpos e microscopia eletrônica, usam esse desfecho para quantificar a mitofagia. Cada método para examinar a mitofagia tem suas vantagens, como o direcionamento específico de tecido/célula (com sensores genéticos) e grande detalhe (com microscopia eletrônica). No entanto, esses métodos geralmente exigem recursos caros, pessoal treinado e um longo tempo de preparação antes do experimento real, como para a criação de animais transgênicos. Aqui, apresentamos uma alternativa custo-efetiva para medir mitofagia usando corantes fluorescentes comercialmente disponíveis visando mitocôndrias e lisossomos. Este método mede efetivamente a mitofagia no nematoide Caenorhabditis elegans e em células hepáticas humanas, o que indica sua potencial eficiência em outros sistemas modelo.

Introdução

As mitocôndrias são essenciais para todos os animais aeróbicos, incluindo os seres humanos. Eles convertem a energia química das biomoléculas em trifosfato de adenosina (ATP) via fosforilação oxidativa¹, sintetizam heme², degradam ácidos graxos através da oxidação β³, regulam a homeostase do cálcio⁴ e ferro⁵, controlam a morte celular pela apoptose⁶ e geram espécies reativas de oxigênio (EROs), que desempenham um papel vital na homeostase redox7. Dois processos complementares e opostos mantêm a....