Retención molecular universal con microscopía de expansión de 11 veces
Summary
Aquí se presenta una nueva versión de microscopía de expansión (ExM), Magnify, que está modificada para una expansión de hasta 11 veces, conservando una amplia gama de clases de biomoléculas y es compatible con una amplia gama de tipos de tejidos. Permite la interrogación de la configuración a nanoescala de biomoléculas utilizando microscopios convencionales limitados por difracción.
Abstract
Las imágenes a nanoescala de especímenes biológicos pueden mejorar la comprensión de la patogénesis de la enfermedad. En los últimos años, se ha demostrado que la microscopía de expansión (ExM) es una alternativa eficaz y de bajo coste a la microscopía óptica de superresolución. Sin embargo, se ha visto limitado por la necesidad de agentes de anclaje específicos y, a menudo, personalizados para retener diferentes clases de biomoléculas dentro del gel y por las dificultades para expandir los formatos de muestras clínicas estándar, como el tejido fijado en formol e incluido en parafina, especialmente si se desean factores de expansión más grandes o epítopos de proteínas preservados. Aquí, describimos Magnify, un nuevo método ExM para una expansión robusta de hasta 11 veces en una amplia gama de tipos de tejidos. Al utilizar metacroleína como anclaje químico entre el tejido y el gel, Magnify retiene múltiples biomoléculas, como proteínas, lípidos y ácidos nucleicos, dentro del gel, lo que permite la obtención de imágenes a nanoescala de los tejidos en microscopios ópticos convencionales. Este protocolo describe las mejores prácticas para garantizar una expansión de tejido robusta y sin grietas, así como consejos para manipular y obtener imágenes de geles altamente expandidos.
Introduction
Los sistemas biológicos exhiben heterogeneidad estructural, desde las extremidades y los órganos hasta los niveles de proteínas a nanoescala. Por lo tanto, una comprensión completa del funcionamiento de estos sistemas requiere un examen visual a través de estas escalas de tamaño. Sin embargo, el límite de difracción de la luz causa desafíos en la visualización de estructuras más pequeñas que ~200-300 nm en un microscopio de fluorescencia convencional. Además, los métodos ópticos de superresolución 1,2,3, como el agotamiento de la emisión estimulada (STED), la microscopía de localización fotoactivada (PALM), la microscopía de reconstrucción óptica estocástica (STORM) y la microscopía de iluminación estructurada (SIM), aunque potentes, presentan sus propios desafíos, ya que requieren hardware y reactivos costosos y, a menudo, tienen tiempos de adquisición lentos y una capacidad deficiente para obtener imágenes de grandes volúmenes en 3D.
La microscopía de expansión4 (ExM) proporciona un medio alternativo para eludir el límite de difracción de la luz mediante el anclaje covalente de biomoléculas en un gel polimérico hinchable en agua y separarlas físicamente, lo que las hace resolubles en microscopios ópticos convencionales. Desde la publicación original de ExM hace menos de una década, se han desarrollado multitud de variantes del protocolo ExM, y estos protocolos permiten la incorporación directa de las proteínas 5,6,7, ARN 8,9,10 o lípidos11,12,13 en la red de gel alterando el anclaje químico o expandiendo aún más la muestra (mejorando así la resolución efectiva), ya sea en un solo paso14 o en múltiples pasos iterativos15,16. Hasta hace poco, ningún protocolo ExM podía retener estas tres clases de biomoléculas con un solo anclaje químico disponible comercialmente, al tiempo que proporcionaba un gel mecánicamente resistente que podía expandirse ~ 10 veces en una sola ronda de expansión.
Aquí, presentamos Magnify17, una adición reciente al arsenal de ExM que utiliza metacroleína como ancla de biomolécula. La metacroleína forma enlaces covalentes con el tejido como el del paraformaldehído, lo que garantiza que se puedan retener múltiples clases de biomoléculas dentro de la red de gel sin necesidad de varios agentes de anclaje específicos o personalizados. Además, esta técnica puede expandir un amplio espectro de tejidos hasta 11 veces, incluidas muestras notoriamente desafiantes, como las muestras clínicas fijadas en formol e incluidas en parafina (FFPE). Los métodos anteriores para expandir muestras mecánicamente rígidas requerían una digestión dura de las proteasas, lo que hacía imposible el marcaje de anticuerpos de las proteínas de interés después de que la muestra se había expandido. Por el contrario, esta técnica logra la expansión de muestras clínicas FFPE utilizando una solución desnaturalizante en caliente, preservando así los epítopos de proteínas enteras dentro del gel, que pueden ser dirigidos para la obtención de imágenes posteriores a la expansión (Figura 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, presentamos el protocolo Magnify 17, una variante ExM que puede retener múltiples biomoléculas con un solo anclaje químico y expandir muestras clínicas FFPE desafiantes hasta11 veces con desnaturalización por calor. Los cambios clave en este protocolo que lo distinguen de otros protocolos ExM incluyen el uso de un gel reformulado que permanece mecánicamente robusto incluso cuando está completamente expandido, así como el uso de metacroleína como anclaje de la biomolécula. Los paso…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la Universidad Carnegie Mellon y la Fundación Benéfica D.S.F. (Y.Z. y X.R.), los Institutos Nacionales de Salud (N.I.H.) Premio al Nuevo Innovador del Director DP2 OD025926-01, y la Fundación Kauffman.
Materials
| 4-hydroxy-TEMPO (4HT) | Sigma Aldrich | 176141 | Inhibitor |
| 6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass) | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| Acrylamide | Sigma Aldrich | A8887 | Gel Monomer component |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma Aldrich | A3678 | Initiatior |
| DAPI (1 mg/mL) | Thermo Scientific | 62248 | |
| Decaethylene glycol mono dodecyl ether (C12E10) | Sigma Aldrich | P9769 | Non-ionic surfactant |
| Diamond knife No. 88 CM | General Tools | 31116 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 0.5 M |
VWR | BDH7830-1 | Homogenization Buffer Component |
| Forceps | |||
| Glycine | Sigma Aldrich | G8898 | Homogenization Buffer Component |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3393 | |
| Methacrolein | Sigma Aldrich | 133035 | Anchoring Agent |
| Micro cover Glass #1 (24x60mm) | VWR | 48393 106 | |
| Micro cover Glass #1.5 (24x60mm) | VWR | 48393 251 | |
| N,N,N′,N′- Tetramethylethylenediamine (TEMED) |
Sigma Aldrich | T9281 | Accelerator |
| N,N′-Methylenebisacrylamide (Bis) | Sigma Aldrich | M7279 | Gel Monomer component |
| N,N-dimethylacrylamide (DMAA) | Sigma Aldrich | 274135 | Gel Monomer component |
| Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 167063 | |
| Nunclon 6-Well Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 140675 | |
| Nunc™ 15mL Conical | Thermo Fisher | 339651 | |
| Nunc™ 50mL Conical | Thermo Fisher | 339653 | |
| Orbital Shaker | |||
| Paint brush | |||
| pH Meter | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution | Fischer Scientific | BP399-1 | |
| Polyethylene glycol 200 | Sigma Aldrich | P-3015 | |
| Proteinase K (Molecular Biology Grade) | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Razor blade | Fischer Scientifc | 12640 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo Fisher | 3457 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL | Thermo Fisher | 3459 | |
| Sodium acrylate (SA) | AK Scientific | R624 | Gel Monomer component |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S6191 | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | C8532-1KG | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma Aldrich | L3771 | Homogenization Buffer Component |
| Tris Base | Fischer Scientific | BP152-1 | Homogenization Buffer Component |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U5378 | Homogenization Buffer Component |
| Xylenes | Sigma Aldrich | 214736 | |
| 20x SSC | Thermo Scientific | AM9763 | |
| Tween20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P8920 |
Referências
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