Gitt deres enkle anatomi, tilbyr Anopheles testikler en god cytologisk modell for å studere spermatogenese. Denne protokollen beskriver helmontert fluorescens in situ hybridisering, en teknikk som brukes til å undersøke denne biologiske prosessen, samt fenotypen av transgene stammer som har mutasjoner i gener involvert i sædproduksjon.
Spermatogenese er en kompleks biologisk prosess der diploide celler gjennomgår suksessiv mitotisk og meiotisk deling etterfulgt av store strukturelle endringer for å danne haploide spermatozoer. Foruten det biologiske aspektet, er studier av spermatogenese av avgjørende betydning for å forstå og utvikle genetiske teknologier som gendrift og syntetiske kjønnsforholdsforvrengninger, som ved å endre henholdsvis mendelsk arv og sædkjønnsforholdet kan brukes til å kontrollere skadedyrpopulasjoner. Disse teknologiene har vist seg å være svært lovende i laboratorieinnstillinger og kan potensielt brukes til å kontrollere ville populasjoner av Anopheles-mygg , som er vektorer av malaria. På grunn av testisanatomiens enkelhet og deres medisinske betydning, representerer Anopheles gambiae, en stor malariavektor i Afrika sør for Sahara, en god cytologisk modell for å studere spermatogenese. Denne protokollen beskriver hvordan helmontert fluorescens in situ hybridisering (WFISH) kan brukes til å studere de dramatiske endringene i cellekjernestruktur gjennom spermatogenese ved bruk av fluorescerende prober som spesifikt flekker X- og Y-kromosomene. FISH krever vanligvis forstyrrelse av reproduktive organer for å eksponere mitotiske eller meiotiske kromosomer og tillate farging av spesifikke genomiske regioner med fluorescerende prober. WFISH muliggjør bevaring av testisens opprinnelige cytologiske struktur, kombinert med et godt nivå av signaldeteksjon fra fluorescerende sonder rettet mot repeterende DNA-sekvenser. Dette gjør det mulig for forskere å følge endringer i kromosomal oppførsel av celler som gjennomgår meiose langs organets struktur, hvor hver fase av prosessen tydelig kan skilles. Denne teknikken kan være spesielt nyttig for å studere kromosommeiotisk parring og undersøke cytologiske fenotyper assosiert med for eksempel syntetiske kjønnsforholdsforvrengere, hybrid mannlig sterilitet og utslag av gener involvert i spermatogenese.
Malaria legger en enorm byrde på helse og velvære for den globale menneskelige befolkningen. I 2021 estimerte Verdens helseorganisasjon (WHO) at malaria forårsaket 619.000 dødsfall, hvorav 96% skjedde i Afrika sør for Sahara1. Sykdommen overføres av mygg som tilhører Anopheles-slekten, og i Afrika sør for Sahara har tre arter, nemlig Anopheles gambiae (An. gambiae), Anopheles coluzzi (An, coluzzi) og Anopheles arabiensis (An. Arabiensis) en uforholdsmessig stor rolle i malariaoverføring, og står for 95% av malariatilfeller globalt. Kontrollprogrammer som er avhengige av tradisjonelle metoder som insektmidler og antimalariamidler har reddet millioner av liv; De siste årene har imidlertid den økende motstanden mot disse kontrollmetodene utfordret deres effektivitet 1,2. I tillegg har restriksjoner pålagt av COVID-19-pandemien påvirket tilgjengeligheten av viktige malariakontrollintervensjoner, som ifølge WHO World Malaria Report 2022 har økt malariaforekomsten1. I de siste to tiårene har nye genetiske kontrollmetoder blitt utviklet i laboratorieinnstillinger for å målrette Anopheles mygg 3,4,5,6,7,8,9,10. Blant disse strategiene virker de som er basert på gendriftsystemer (GDS) og syntetiske kjønnsforholdsforvrengere (SD) lovende. GDS er avhengige av muligheten for å overføre, med svært høy frekvens, en genetisk modifikasjon som påvirker kvinnelig fruktbarhet eller svekker parasittenes livssyklus i myggen 5,11,12. SD-er handler i stedet ved å forskyve kjønnsforholdet mellom et myggavkom mot hanner, noe som over tid fører til kollaps av en målpopulasjon på grunn av mangel på kvinner 4,6,13. Hovedkomponentene i disse genetiske systemene virker primært på myggens reproduktive organer, hvor gameter, egg og sæd produseres etter meiotisk deling14.
I denne protokollen brukes fremskritt innen cytogenetiske teknikker for å utforske spermatogenese i An. gambiae med fokus på kromosomenes oppførsel in situ. Strukturen til myggtestisene og de biologiske prosessene som foregår i den, har tidligere blitt undersøkt ved hjelp av en rekke cytologiske metoder, for eksempel immunfluorescens, fluorescerende reportertransgener og DNA- og RNA-fluorescens in situ-hybridisering (FISH)15,16,17,18,19,20; Organene viser en spindellignende form, hvor den nedre polen er festet til en deferent kanal forbundet med de mannlige tilbehørskjertlene. I den øvre polen prolifererer germline stamceller nisje og differensierer til spermatogoniceller innebygd i spermatocyster dannet av somatiske celler. Etter flere runder med mitotisk deling, skiller spermatogonia seg inn i spermatocytter, som går inn i meiose. Ved profase parrer autosomer og kjønnskromosomer seg med sine homologer, og kryssing finner sted. Etter de meiotiske divisjonene genereres runde haploide spermatider og går inn i spermiogenese, og denne prosessen fører til dannelsen av modne haploide spermatozoer der cytoplasma er fjernet, nukleærkromatinet kondenseres, og flagella oppstår ved den basale delen av kjernene21,22 (figur 1 og figur 2).
Generelt starter spermiogenese rundt midten av puppestadiet, og modne spermatozoer kan påvises i sent puppestadium i sædreservoaret23. Modningsprosessen av spermatocystene fortsetter i voksenlivet23,24,25. I Anopheles-testikler kan hvert trinn av spermatogenese lett identifiseres ved å se på cellemorfologien i hver spermatocyst (figur 2). Helmontert fluorescens in situ hybridisering (WFISH), beskrevet i denne protokollen, tillater forskere å spesifikt merke en kromosomal region og spore den under spermatogenese samtidig som den opprinnelige strukturen til organ- og cellekjerneposisjonen opprettholdes; Dette representerer en fordel sammenlignet med standard DNA FISH-protokoll der orgelet vanligvis klemmes, noe som fører til vevskader19. I den nåværende protokollen brukes fluorescerende prober til å flekke repeterende sekvenser på kjønnskromosomene og dermed spore deres oppførsel under spermatogenese, fra diploide delende celler til modne haploide spermatozoer. WFISH kan være spesielt nyttig for å studere kjønnskromosommeiotisk parring og undersøke cytologiske fenotyper assosiert med for eksempel syntetiske kjønnsforholdsforvrengere, hybrid mannlig sterilitet og utslag av gener involvert i spermatogenese 4,19,26,27.
Gitt sin rolle som malariavektorer, er Anopheles-mygg målet for et økende antall genetiske vektorkontrollstrategier, som ofte virker i reproduktive organer av disse organismene. Det er generert flere myggmutanter og cytologiske fenotyper som krever at nye cytologiske teknikker undersøkes26,27,28,29. Metoden beskrevet i denne studien kaster lys over forståelsen av spermatogenese, samt de cytologiske mekanismene bak genetiske strategier som har potensial til å kontrollere malariaoverførende mygg.
Vanligvis krever FISH-protokoller klemming av organet av interesse for å tillate kromosomfarging. Dette fører til tap av informasjon om det romlige arrangementet av cellene i det organet33. Denne protokollen beskriver hvordan biologiske prosesser, som spermatogenese, kan studeres in situ samtidig som testisens intakte opprinnelige struktur opprettholdes og dens interne cytologiske organisasjon. Prober rettet mot forskjellige DNA-repeterende elementer, som er spesielt beriket i kjønnskromosomer20, kan samtidig brukes til å avsløre dynamikken i sædmodning. Avhengig av tidspunktet for testisdisseksjonen, tilbyr WFISH muligheten til å studere ulike stadier av spermatogenese gjennom myggutvikling. WFISH er nyttig for å studere spesifikke fenomener som hybrid inkompatibilitet, som i Anopheles-mygg skyldes tilstedeværelsen av meiotiske defekter som premeiotisk svikt og kjønnskromosom ikke-disjunksjon 19,34,35. Foruten det biologiske aspektet, er spermatogenese målet for en rekke genetiske strategier utviklet for å kontrollere skadedyrinsekter som Anopheles mygg. I denne sammenhengen har det X-bundne rDNA-lokuset til An. gambiae blitt brukt som et mål for å utvikle en syntetisk kjønnsforholdsforvrengning, som ved å skade X-bærende sædceller forstyrrer avkommet mot hanner 4,8,13.
Denne teknologien speiler virkningen av naturlig kjønnsforhold meiotiske stasjoner som har blitt identifisert i flere taxa, inkludert mygg, men som fortsatt er dårlig forstått 28,36,37,38,39,40,41. WFISH tilbyr muligheten til å undersøke dette fenomenet og baner vei for raffinering eller forbedring av kjønnsforvrengningsbaserte genetiske strategier ved for eksempel å gi informasjon om hvordan cytologien av sædproduksjon påvirkes av valg av målsteder som brukes til kjønnskromosommakulering. Selv om WFISH etter vår erfaring viser store sjanser for suksess, kan fiasko fortsatt oppstå. Dette kan skyldes et ineffektivt nivå av vevspermeabilisering, som kan overvinnes ved å øke inkubasjonstiden til den penetrerende løsningen. Alternativt kan Proteinase K brukes under permeabiliseringstrinnet. I noen tilfeller la vi merke til et ujevnt nivå av sondepenetrasjon, med et høyere signal i spermatocytkjerner og et lavere eller fraværende signal i meiotiske og spermiogenesestadier. Dette kan skyldes en forskjell i permeabiliseringsnivået avhengig av cellestadiet. I tillegg viste WFISH seg å være verdifull ved bruk av fluorescerende prober designet for å målrette DNA-sekvenser som er tilstede i høye kopinumre. Ved målretting av enkeltkopigener kan det hende at signaldeteksjonen ikke er tilstrekkelig. I dette tilfellet må metoder for signalforsterkning, som tyramidsignalforsterkning (TSA), integreres42.
Denne protokollen kan kombineres med immunfarging eller med transgene reporterstammer som har germline-spesifikke fluorescerende markører16,18, da dette vil legge til informasjon om proteinlokalisering og genuttrykk in situ. I dette arbeidet beskrives WFISH som en teknikk for å undersøke spermatogenese hos Anopheles-mygg; Men gitt den delte anatomien til mannlige reproduktive organer, kan denne protokollen brukes på andre myggarter som spiller en rolle i sykdomsoverføring. På samme måte kan kvinnelig gametogenese undersøkes ved hjelp av denne teknikken. I tillegg kan cytologiske studier i organer eller vev av interesse, som myggmidgut, som er et mål for parasittinvasjon, eller atypisk genetisk bakgrunn, som de i hybridmygg, utforskes43. Videre kan denne teknikken potensielt overføres til andre organismer innenfor Diptera-ordenen.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra Bill &; Melinda Gates Foundation og Open Philanthropy. Vi takker Facility for Imaging by Light Microscopy (FILM) ved Imperial College London for mikroskopianalysen. Figur 2 ble laget med Biorender.com.
Amersham CyDye Fluorescent Nucleotides, Cy3-dUTP | Cytiva | PA53022 | |
Amersham CyDye Fluorescent Nucleotides, Cy5-dUTP | Cytiva | PA55022 | |
ART Wide Bore Filtered Pipette Tips | ThermoFisher Scientific | 2079GPK | |
CytoBond Removable Coverslip Sealant | SciGene | 2020-00-1 | |
Dextran sulfate sodium salt from Leuconostoc spp. | Sigma-Aldrich | D8906-5G | |
DNeasy Blood & Tissue Kits | Qiagen | 69504 | |
Embryo Dishes | VWR | 70543-30 | |
Ethanol, molecular grade | Sigma-Aldrich | 51976 | |
Formamide | ThermoFisher Scientific | 17899 | |
GoTaq G2 DNA Polymerase | Promega | M7841 | |
Hydrochloric acid, 37% | Sigma-Aldrich | 320331 | |
Microscope slides, SuperFrost | VWR | 631-0114 | |
PBS (10x), pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 70011044 | |
Pierce 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | ThermoFisher Scientific | 28906 | |
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | ThermoFisher Scientific | P36941 | |
RNase A/T1 Mix | ThermoFisher Scientific | EN0551 | |
Set of dATP, dCTP, dGTP, dTTP | Promega | U1330 | |
Sodium Acetate Solution | ThermoFisher Scientific | R1181 | |
SP8 inverted confocal microscope | Leica | ||
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9036-19-5 | |
TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
UltraPure Salmon Sperm DNA Solution | ThermoFisher Scientific | 15632011 | |
UltraPure SSC 20x | ThermoFisher Scientific | 15557044 | |
Primer sequences | |||
5’-CAATAAATTTCCTTTTTAATGATGC AAAATCTACGTCTCTAGC-3’-[Fluorochrome] |
Eurofins Genomics | Contig_240 (X) | |
5’AGAAGAATAGAATCAGAATAGT CGG TTTCTTCATCCTGAAAGCC-3’-[Fluorochrome] |
Eurofins Genomics | AgY53B (Y) | |
5’-TTCTAAGTTTCTAGGCTTTAAGGA T GAAGAAACCGACTATTC-3’-[Fluorochrome] |
Eurofins Genomics | AgY477- AgY53B junction region (Y) |
|
F: AACTGTGGAAAAGCCAGAGC R: TCCACTTGATCCTTGCAAAA |
Eurofins Genomics | 18S rDNA (X) | |
F: CCTTTAAACACATGCTCAAATT R: GTTTCTTCATCCTTAAAGCCTAG |
Eurofins Genomics | AgY53B (Y) |