体外研究双-3-氯哌啶对G-四链体DNA结构的化学定位
Summary
双-3-氯哌啶 （B-CePs） 是有用的化学探针，用于在体外鉴定和表征 DNA 模板中的 G-四链 体结构。该协议详细介绍了用B-CeP进行探测反应和通过高分辨率聚丙烯酰胺凝胶电泳分离反应产物的过程。
Abstract
G-四链体 （G4s） 是生物学相关的非典型 DNA 结构，在基因表达和疾病中起重要作用，代表重要的治疗靶点。在潜在的 G 四链体形成序列 （PQS） 中对 DNA 进行 体外 表征需要可用的方法。B-CeP是一类烷化剂，已被证明是研究核酸高级结构的有用化学探针。本文描述了一种新的化学定位分析方法，利用 B-CePs 与鸟嘌呤 N7 的特异性反应性，然后在烷基化 Gs 处直接链裂解。
也就是说，为了区分 G4 折叠和未折叠的 DNA 形式，我们使用 B-CeP 1 探测凝血酶结合适配体 （TBA），这是一种能够承担 G4 排列的 15 聚体 DNA。B-CeP 响应鸟嘌呤与 B-CeP 1 的反应产生的产物可以通过高分辨率聚丙烯酰胺凝胶电泳 （PAGE） 在单核苷酸水平上解析，方法是在烷基化鸟嘌呤上定位单个烷基化加合物和 DNA 链切割。使用 B-CePs 进行定位是一种简单而强大的工具，用于体 外 表征 G-四链体形成的 DNA 序列，能够精确定位参与 G-四链体形成的鸟嘌呤。
Introduction
除了典型的 Watson-Crick 双螺旋结构外，核酸还可以采用各种二级结构，例如替代的 G-四链体 （G4） 形式，因为它们富含鸟嘌呤的序列。G4 结构基于平面四聚体的形成，称为 G-四聚体，其中四个鸟嘌呤通过 Hoogsteen 氢键相互作用。G-四分体通过在鸟嘌呤核心中心配位的一价阳离子堆叠并进一步稳定（图1）1。
图 1：G 四链体结构的示意图。 （A） G-四联体的示意图。平面阵列通过Hoogsteen碱基配对和中心阳离子（M +）稳定。请点击这里查看此图的较大版本.
具有至少两个连续鸟嘌呤核苷酸的四次或更多次运行的序列是潜在的 G 四链体形成序列 （PQS），它们可以折叠成 G 四链体结构。PQS 位于许多不同的细胞环境中，例如端粒、基因启动子、核糖体 DNA 和重组位点，并参与许多生物过程的调节2。因此，目前主要通过计算工具进行的人类基因组中 G4 的鉴定和实验验证是一个生物学相关问题3。为了支持计算预测或检测不可预测的 G4 结构，本文展示了一种基于化学图谱的可识别方法，用于识别 DNA 模板中 G4 的形成，从而能够精确识别形成 G-四体结构的鸟嘌呤。
报道的化学定位分析利用了双-3-氯哌啶 （B-CePs） 在 G4 结构形成后与鸟嘌呤的不同反应性。由于 B-CeP 与亲核试剂 4,5,6,7,8,9 的高反应性，因此是核酸烷基化剂，能够非常有效地与鸟嘌呤核苷酸10 的 N 7 位置反应。烷基化之后是单链和双链 DNA 构建体中的脱嘌呤和链切割。相反，参与 G4 排列中 G-四分体形成的鸟嘌呤不受 B-CeP 烷基化的影响，因为鸟嘌呤的 N7 位置与 Hoogsteen 氢键有关。B-CePs 的这种特异性反应性不仅可以检测 G4 结构，还可以鉴定形成四联体的鸟嘌呤，因为与单链和双链 DNA 中的鸟嘌呤相比，它们可以从相对保护中推断出免受烷基化的影响。
本文报道了使用 B-CeP 1（图 2A）作为表征凝血酶结合适配体 （TBA） 的探针的化学定位方案，TBA 是一种 15 聚体 DNA，能够在钾阳离子存在下呈现 G4 排列11,12。将TBA（G4-TBA）的G4排列直接与两个对照进行比较，即单链形式的TBA（ssTBA）和TBA退火到其互补序列以形成双链结构（dsTBA）（表1）。探测反应产物通过在烷基化鸟嘌呤上定位单个烷基化加合物和 DNA 链切割，在单核苷酸水平上通过高分辨率聚丙烯酰胺凝胶电泳 （PAGE） 进行解析。通过将TBA寡核苷酸与3’端的荧光基团偶联，可以在凝胶上实现可视化（表1）。该协议显示了如何将TBA折叠在其不同的构象（G4和对照）中，以及如何使用B-CeP后跟PAGE进行探测反应。
Protocol
Representative Results
Discussion
G-四链体是核酸二级结构，通常折叠在富含鸟嘌呤的DNA序列中，并且由于它们与遗传控制和疾病有关，因此是重要的研究目标。B-CePs 的化学定位是表征 DNA G4s 的有用方案，可用于鉴定在生理盐条件下参与 G-四分体形成的鸟嘌呤碱基。
该协议中使用的化学探针是B-CeP 1（图2A），其通过与鸟嘌呤核碱基的 N7特异性反应，可以区分参与G-四链体四链体形…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了帕多瓦大学制药和药理学系（PRIDJ-BIRD2019）的支持。
Materials
| Acrylamide/bis-acrylamide solution 40% | Applichem | A3658 | R45-46-20/21-25-36/38-43-48/23/ 24/25-62 |
| Ammonium per-sulfate (APS) | Sigma Aldrich | A7460 | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | ||
| Autoclave | pbi international | ||
| Boric acid | Sigma Aldrich | B0252 | |
| Bromophenol blue Brilliant blue R | Sigma Aldrich | B0149 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate dodecahydrate | Fluka | 71649 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | 276855 | |
| DNA oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | synthesis of custom sequences | |
| EDTA disodium | Sigma Aldrich | E5134 | |
| Formamide | Fluka | 40248 | H351-360D-373 |
| Gel imager | GE Healtcare | STORM B40 | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G5516 | |
| Micro tubes 0.5 mL | Sarstedt | 72.704 | |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P9541 | |
| Sequencing apparatus | Biometra | Model S2 | |
| Silanization solution I | Fluka | 85126 | H225, 314, 318, 336, 304, 400, 410 |
| Sodium phosphate monobasic | Carlo Erba | 480086 | |
| Speedvac concentrator | Thermo Scientific | Savant DNA 120 | |
| TEMED | Fluka | 87689 | R11-21/22-23-34 |
| Tris-HCl | MERCK | 1.08387.2500 | |
| Urea | Sigma Aldrich | 51456 | |
| UV-Vis spectrophotometer | Thermo Scientific | Nanodrop 1000 |
Referências
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