Agrobacterium tumefaciens-medierad genteknik av gröna mikroalger, Chlorella vulgaris
Summary
Detta protokoll beskriver användningen av Agrobacterium tumefaciens-medierad transformation (AMT) för att integrera gener av intresse i kärngenomet hos den gröna mikroalgen Chlorella vulgaris, vilket leder till produktion av stabila transformanter.
Abstract
Agrobacterium tumefaciens-medierad transformation (AMT) fungerar som ett allmänt använt verktyg för att manipulera växtgenom. A. tumefaciens uppvisar dock förmågan till genöverföring till en mängd olika arter. Många arter av mikroalger saknar väletablerade metoder för att på ett tillförlitligt sätt integrera gener av intresse i sin kärnarvsmassa. För att utnyttja de potentiella fördelarna med bioteknik med mikroalger är enkla och effektiva verktyg för genmanipulation avgörande. Häri presenteras ett optimerat AMT-protokoll för den industriella mikroalgararten Chlorella vulgaris, med hjälp av det gröna fluorescerande proteinet (mGFP5) och markören för antibiotikaresistens för Hygromycin B. Mutanter selekteras genom plätering på Tris-Acetat-Fosfat (TAP) media innehållande Hygromycin B och cefotaxim. Uttrycket av mGFP5 kvantifieras via fluorescens efter över tio generationer av subkultur, vilket indikerar den stabila omvandlingen av T-DNA-kassetten. Detta protokoll möjliggör tillförlitlig generering av flera transgena C. vulgaris-kolonier på mindre än två veckor, med hjälp av den kommersiellt tillgängliga pCAMBIA1302-växtuttrycksvektorn.
Introduction
Agrobacterium tumefaciens, en gramnegativ jordburen bakterie, har en unik genöverföringsförmåga mellan kungadömena, vilket ger den titeln “naturlig genetisk ingenjör“1. Denna bakterie kan överföra DNA (T-DNA) från en tumörinducerande plasmid (Ti-plasmid) till värdceller genom ett typ IV-sekretionssystem, vilket resulterar i integration och uttryck av T-DNA i värdgenomet 1,2,3,4. I den naturliga miljön leder denna process till tumörbildning i växter, allmänt känd som krongallsjukdom. Agrobacterium kan dock också överföra T-DNA till olika andra organismer, inklusive jäst, svampar, alger, sjöborrembryon och till och med mänskliga celler under laboratorieförhållanden 5,6,7,8.
Genom att utnyttja detta naturliga system möjliggör Agrobacterium tumefaciens-medierad transformation (AMT) slumpmässig integration av gener av intresse i en värdcells kärngenom genom genom att modifiera T-DNA-regionen i Ti-plasmiden. För detta ändamål är en allmänt använd AMT-växtuttrycksvektor pCAMBIA13029. Forskare kan använda enkla kloningsarbetsflöden i E. coli innan de överför den önskade vektorn till A. tumefaciens för efterföljande överföring till värden av intresse.
Gröna mikroalger är eukaryoter som har många likheter med landväxter men som är mycket motsträviga mot genetisk modifiering. Genetisk omvandling spelar dock en avgörande roll i både grundforskning och bioteknisk forskning om mikroalger. I flera arter av mikroalger, särskilt Chlamydomonas reinhardtii, har genetisk transformation via AMT framgångsrikt introducerat transgener som humant interleukin-2 (hIL-2), receptorbindande domänen för svårt akut respiratoriskt syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2 RBD) och två antimikrobiella peptider (AMP)10,11,12,13. Bland dessa har Chlorella vulgaris, en mindre kräsen och snabbväxande grönalgsart, en betydande potential för hållbar produktion av kolhydrater, proteiner, nutraceuticals, pigment och andra högvärdiga föreningar14. Bristen på tillförlitliga verktyg för att skapa transgena stammar av C. vulgaris hämmar dock dess kommersiella framsteg. Eftersom det bara har publicerats ett begränsat antal arbeten som använder AMT i C. vulgaris15, och med tanke på de stora skillnaderna mellan odling av växter och mikroalger, blir det viktigt att optimera AMT-protokollet.
I denna studie satte forskarna in grönt fluorescerande protein (mGFP5) nedströms blomkålsmosaikviruset (CamV) 35S-promotorn och lade till en histidintagg för att använda den som en reportergen för proteinuttryck. Transformanter valdes ut med hjälp av hygromycin B, och efter subkultivering i över tjugo generationer förblev omvandlingen stabil. Plasmiden pCAMBIA1302 som används i detta arbete kan lätt anpassas för att innehålla vilken gen som helst av intresse. Dessutom kan metoden och materialen som presenteras anpassas för andra grönalgsarter med en aktiv CamV35S-promotor, eftersom denna promotor används för hygromycinselektion.
Protocol
Representative Results
Discussion
Omvandlingens effektivitet är förknippad med flera olika parametrar. Valet av A. tumefaciens-stammar som används för AMT är avgörande. AGL-1 är en av de mest invasiva stammarna som upptäckts och har därför använts rutinmässigt i AMT. Att komplettera induktionsmediet med glukos (15-20 mM) är också viktigt för AMT-effektiviteten. Med tanke på att C. vulgaris kan växa under både fototrofa och heterotrofa förhållanden, utelämnas ofta glukos eller andra kolkällor från mikroalgmedier f?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Prof. Paul Hooykaas för att ha tillhandahållit pCAMBIA1302-vektorn och Agrobacterium tumefaciens AGL1 från Institute of Biology Leiden, Leiden University, Nederländerna. Författarna vill också tacka Eva Colic för hennes hjälp med att odla de fluorescerande transformanterna. Detta arbete finansierades av Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada och Mitacs Accelerate-programmet.
Materials
| 1 Kb Plus DNA ladder | FroggaBio | DM015 | |
| Acetosyringone | Fisher Scientific | D26665G | |
| Agrobacterium tumefaciens | Gold Biotechnologies | Strain: AGL-1; Gift from Prof. Paul Hooykaas | Genotype: C58 RecA (RifR/CarbR) pTiBo542DT-DNA |
| Biotin | Enzo Life Sciences | 89151-400 | |
| CaCl2·2H2O | VWR | BDH9224-1KG | |
| Cefotaxime | AK Scientific | J90010 | |
| Chlorella vulgaris | University of Texas at Austin Culture Collection of Algae | Strain: UTEX 395 | Wildtype strain |
| CoCl2·6H2O | Sigma Aldrich | C8661-25G | |
| CuSO4·5H2O | EMD Millipore | CX2185-1 | |
| FeCl3·6H2O | VWR | BDH9234-500G | |
| Gene Pulser Xcell Electroporator | Bio-Rad | 1652662 | Main unit equipped with PC module. |
| GeneJET Plant Genome Purification Kit | Thermo Scientific | K0791 | |
| Glacial acetic acid | VWR | CABDH3093-2.2P | |
| Glycerol | BioBasic | GB0232 | |
| HEPES Buffer | Sigma Aldrich | H-3375 | |
| Hygromycin B | Fisher Scientific | AAJ6068103 | |
| K2HPO4 | VWR | BDH9266-500G | |
| Kanamycin | Gold Biotechnologies | K-250-25 | |
| KH2PO4 | VWR | BDH9268-500G | |
| MgSO4·7H2O | VWR | 97062-134 | |
| MnCl2·4H2O | JT Baker | BAKR2540-01 | |
| Na2CO3 | VWR | BDH7971-1 | |
| Na2EDTA·2H2O | JT Baker | 8993-01 | |
| Na2MoO4·2H2O | JT Baker | BAKR3764-01 | |
| NaCl | VWR | BDH7257-7 | |
| NaH2PO4 H2O | Millipore Sigma | CA80058-650 | |
| NaNO3 | VWR | BDH4574-500G | |
| NEBExpress Ni Resin | NewEngland BioLabs | NEB #S1427 | |
| NH4Cl | VWR | BDH9208-500G | |
| pCAMBIA1302 | Leiden University | Gift from Prof. Paul Hooykaas | pBR322, KanR, pVS1, T-DNA(CaMV 35S/HygR/CaMV polyA, CaMV 35S promoter/mgpf5-6xhis/NOS terminator) |
| Polypropylene Columns (5 mL) | QIAGEN | 34964 | |
| Precision Plus Protein Unstained Protein Standards, Strep-tagged recombinant, 1 mL | Bio-Rad | 1610363 | |
| Rifampicin | Millipore Sigma | R3501-1G | |
| SunBlaster LED Strip Light 48 Inch | SunBlaster | 210000000906 | |
| Synergy 4 Microplate UV/Vis spectrometer | BioTEK | S4MLFPTA | |
| Tetracycline | Thermo Scientific Chemicals | CAAAJ61714-14 | |
| TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 12% | Bio-Rad | 1610185 | |
| Thiamine | TCI America | T0181-100G | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Tryptone | BioBasic | TG217(G211) | |
| Vitamin B12 (cyanocobalamin) | Enzo Life Sciences | 89151-436 | |
| Yeast Extract | BioBasic | G0961 | |
| ZnSO4·7H2O | JT Baker | 4382-01 |
Referências
- Smith, E. F., Townsend, C. O. A plant tumor of bacterial origin. Science. 25 (643), 671-673 (1907).
- Chilton, M. D., et al. Stable incorporation of plasmid DNA into higher plant cells: The molecular basis of tumorigenesis. Cell. 11 (2), 263-271 (1977).
- De Cleene, M., De Ley, J. The host range of crown gall. The Botanical Review. 42, 389-466 (1976).
- Hooykaas, P. J., Schilperoort, R. A. Agrobacterium and plant genetic engineering. Plant Molecular Biology. 19, 15-38 (1992).
- Bundock, P., den Dulk-Ras, A., Beijersbergen, A., Hooykaas, P. J. J. Transkingdom T-DNA transfer from Agrobacterium tumefaciens to Saccharomyces cerevisiae. The European Molecular Biology Organization. 14 (13), 3206-3214 (1995).
- Piers, K. L., Heath, J. D., Liang, X., Stephens, K. M., Nester, E. W. Agrobacteriumtumefaciens-mediated transformation of yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (4), 1613-1618 (1996).
- Kumar, S. V., Misquitta, R. W., Reddy, V. S., Rao, B. J., Rajam, M. V. Genetic transformation of the green alga-Chlamydomonas reinhardtii by Agrobacteriumtumefaciens. Plant Science. 166 (3), 731-738 (2004).
- de Groot, M. J., Bundock, P., Hooykaas, P. J., Beijersbergen, A. G. Agrobacteriumtumefaciens-mediated transformation of filamentous fungi. Nature Biotechnology. 16 (9), 839-842 (1998).
- Hajdukiewicz, P., Svab, Z., Maliga, P. The small, versatile pPZP family of Agrobacterium binary vectors for plant transformation. Plant Molecular Biology. 25 (6), 989-994 (1994).
- Dehghani, J., Adibkia, K., Movafeghi, A., Pourseif, M. M., Omidi, Y. Designing a new generation of expression toolkits for engineering of green microalgae; robust production of human interleukin-2. BioImpacts. 10 (4), 259-268 (2020).
- Berndt, A. J., Smalley, T. N., Ren, B., Simkovsky, R., Badary, A., Sproles, A. E., Fields, F. J., Torres-Tiji, Y., Heredia, V., Mayfield, S. P. Recombinant production of a functional SARS-CoV-2 spike receptor binding domain in the green algae Chlamydomonas reinhardtii. PLoS One. 16, 0257089 (2021).
- Li, A., Huang, R., Wang, C., Hu, Q., Li, H., Li, X. Expression of anti-lipopolysaccharide factor isoform 3 in Chlamydomonas reinhardtii showing high antimicrobial activity. Marine Drugs. 19 (5), 239 (2021).
- Xue, B., Dong, C. M., Hu, H. H., Dong, B., Fan, Z. C. Chlamydomonas reinhardtii-expressed multimer of ToAMP4 inhibits the growth of bacteria of both Gram-positive and Gram-negative. Process Biochemistry. 91, 311-318 (2020).
- Khan, M. I., Shin, J. H., Kim, J. D. The promising future of microalgae: current status, challenges, and optimization of a sustainable and renewable industry for biofuels, feed, and other products. Microbial Cell Factories. 17, 36 (2018).
- Cha, T. S., Yee, W., Aziz, A. Assessment of factors affecting Agrobacterium-mediated genetic transformation of the unicellular green alga, Chlorella vulgaris. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 28, 1771-1779 (2012).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments. (62), e3923 (2012).
- Bio-Rad Laboratories Inc. A Guide to Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Detection. Bulletin 6040, Rev C. Bio-Rad Laboratories Inc. Accessed. , (2023).
- NEBExpress Ni Resin Gravity Flow Typical Protocol. New England Biolabs Inc Available from: https://international.neb.com/protocols/2019/09/10/nebexpress-ni-resin-gravity-flow-typical-protocol (2023)
- Ward, V. C. A., Rehmann, L. Fast media optimization for mixotrophic cultivation of Chlorella vulgaris. Scientific Reports. 9, 19262 (2019).
- Morton, E. R., Fuqua, C. Laboratory maintenance of Agrobacterium. Current Protocols in Microbiology. , (2012).
- Haddadi, F., Abd Aziz, M., Abdullah, S. N., Tan, S. G., Kamaladini, H. An efficient Agrobacterium-mediated transformation of strawberry cv. Camarosa by a dual plasmid system. Molecules. 20 (3), 3647-3666 (2015).
- Wang, X., Ryu, D., Houtkooper, R. H., Auwerx, J. Antibiotic use and abuse: a threat to mitochondria and chloroplasts with impact on research, health, and environment. Bioessays. 37 (10), 1045-1053 (2015).
- Gelvin, S. B. Plant DNA repair and Agrobacterium T-DNA integration. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 8458 (2021).
