Dette papir præsenterer en detaljeret protokol til opdræt af kålhvid sommerfugl under kontrollerede laboratorieforhold med en kunstig kost, som muliggør præcise manipulationer af tidlig ernæring og toksineksponering. De repræsentative resultater viser, hvordan tungmetaltoksicitet kan analyseres med denne protokol.
Den kålhvide sommerfugl (Pieris rapae) er et vigtigt system til anvendt skadedyrsbekæmpelse forskning og grundforskning i adfærdsmæssig og ernæringsmæssig økologi. Kålhvide kan let opdrættes under kontrollerede forhold på en kunstig diæt, hvilket gør dem til en modelorganisme i sommerfugleverdenen. I dette papir bruges en manipulation af tungmetaleksponering til at illustrere grundlæggende metoder til opdræt af denne art. Den generelle protokol illustrerer, hvordan sommerfugle kan fanges i marken, tilskyndes til at lægge æg i drivhusbure og overføres som larver til kunstig kost. Metoderne viser, hvordan sommerfugle kan markeres, måles og studeres for en række forskningsspørgsmål. De repræsentative resultater giver en idé om, hvordan kunstige kostvaner, der varierer i komponenter, kan bruges til at vurdere sommerfuglens ydeevne i forhold til en kontroldiæt. Mere specifikt var sommerfugle mest tolerante over for nikkel og mindst tolerante over for kobber med en tolerance over for zink et sted i midten. Mulige forklaringer på disse resultater diskuteres, herunder nikkel hyperakkumulering i nogle sennep værtsplanter og nylige beviser i insekter, at kobber kan være mere giftigt end tidligere værdsat. Endelig gennemgår diskussionen først variationer i protokollen og anvisninger til fejlfinding af disse metoder, før man overvejer, hvordan fremtidig forskning yderligere kan optimere den kunstige diæt, der anvendes i denne undersøgelse. Samlet set giver denne protokol ved at give en detaljeret videooversigt over opdræt og måling af kålhvider på kunstig kost en ressource til brug af dette system på tværs af en lang række undersøgelser.
Den lille kålhvide sommerfugl (Pieris rapae, herefter “kålhvid”) er en kosmopolitisk skadedyrsart af sennepsafgrøder, såsom kål, broccoli og raps 1,2,3. Samtidig er kålhviden et kraftfuldt system til forskning i biologi og en almindeligt anvendt sommerfuglemodel, da de let kan opdrættes og manipuleres i kontrollerede laboratorieforsøg 4,5. Forskning i kålhvide sommerfugle har givet kritisk indsigt med hensyn til værtssøgning 6,7,8, nektarressourceforbrug9,10,11, valg af partner og seksuel selektion 12,13,14, vingemønsterudvikling og evolution15,16,17 og reaktioner på nye og skiftende Miljøer18,19. Mange af disse indsigter er afhængige af det faktum, at kålhvide kan opdrættes på kunstige kostvaner 4,20,21, som præcist kan manipuleres til at afspejle dårlige ernæringsforhold 22,23, økologisk relevante forurenende niveauer 24,25,26,27 eller overgange til nye værtsplanter28,29. Denne undersøgelse bruger et eksperiment om eksponering for tungmetaller til at illustrere grundlæggende metoder til opdræt af kålhvide sommerfugle på en kunstig diæt i laboratoriet og vigtige præstationsmål for larver og voksne. Mange aspekter af disse metoder gælder for andre sommerfugle 30,31 og møl32,33,34, der kan opdrættes på en kunstig kost.
I dette papir bruges et eksperiment om metaltolerance til at illustrere de generelle metoder til opdræt af kålhvide sommerfugle. Tungmetaller er et almindeligt menneskeskabt forurenende stof, der stammer fra nedbrydning af menneskelige produkter, industrielle processer og arvforurening fra historisk brug i pesticider, maling og andre produkter35,36,37,38. Mange tungmetaller, herunder bly, kobber, zink og nikkel, kan bevæge sig fra jord og vand til plantevæv 39,40,41,42, og metaller i støv kan deponeres på planteblade43,44,45, hvilket resulterer i flere eksponeringsveje for phytophagous insektlarver. Tungmetaleksponering tidligt i livet kan have negative virkninger på dyrs udvikling, især på neuralt væv, og høje niveauer kan være dødelige 35,36,46,47,48. En række undersøgelser har vist de negative virkninger af metaleksponering på udviklende insekter, herunder både skadedyr og gavnlige insekter 49,50,51. Det store antal tungmetalforurenende stoffer og det faktum, at de ofte forekommer sammen i menneskelige miljøer52, betyder, at der er behov for præcise laboratoriemetoder, hvor forskere kan udsætte udviklende insekter for forskellige niveauer og kombinationer af forskellige metaller for at forstå og afbøde deres miljøpåvirkninger.
Dette arbejde kontrasterer virkningerne af almindelige metaller på kålhvid overlevelse og udvikling med fokus på kobber (Cu), zink (Zn) og nikkel (Ni), tre almindelige forurenende stoffer i menneskelige miljøer. For eksempel indeholder forbs fra landdistrikterne Minnesota vejkanter op til 71 ppm Zn, 28 ppm Cu og 5 ppm Ni53. Dette eksperiment manipulerer niveauerne af disse metaller i kunstige kostvaner af kålhvide sommerfugle på niveauer, der svarer til og overstiger de niveauer, der ses i miljøet. En kunstig diæt bruges til at kontrastere disse metallers relative toksicitet og forudsiger, at kålhvide ville være mere følsomme over for metalforurenende stoffer, der ikke er en integreret del af deres fysiologi (nikkel) i forhold til dem, der forekommer, omend på små niveauer, i enzymer og væv (kobber og zink; Figur 1). Hele vejen igennem giver denne tekst metodologiske detaljer og ledsagende videovisualiseringer for at illustrere opdræts- og forskningsmetoderne i dette vigtige sommerfuglemodelsystem.
I denne forskning blev kålhvide sommerfugle (Pieris rapae) opdrættet på en kunstig diæt for at undersøge forskelle i tungmetaltoksicitet. Dermed giver denne undersøgelse generelle metoder til opdræt og laboratorieundersøgelser af dette let at manipulere sommerfuglesystem. Denne diskussion overvejer først mere generelle spørgsmål om de metoder, der gennemgås her, gennemgår derefter vores videnskabelige resultater, før vi slutter med refleksioner over komponenterne i den kunstige kost.
Den protokol, der gennemgås her, giver trin i en generel opdrætsmetode for kålhvide sommerfugle, men der er mange punkter i denne protokol, der kan justeres. For eksempel, mens casestudiet, der præsenteres her, bruger svampe til fodring, har andre forskere haft held med tandvæger og silkeblomster fyldt med honningvand5. Mens den nuværende undersøgelse bruger honningvand som mad, har andre forskere brugt sukkeropløsninger og endda Gatorade. Hvis pupper skal vejes eller flyttes til andre betingelser for fremkomst (f.eks. Inducering af diapause og behov for køleopbevaring i 1 måned), kan forskeren let fjerne dem fra kopperne ved at spritte dem med vand for at fugte deres silkevedhæftninger og gribe dem med fjertang og derefter hænge dem igen ved hjælp af dobbeltsidet tape. Hvis forskere har brug for mere fleksibilitet med hensyn til, hvornår voksne sommerfugle flyttes ind i bure for voksen adfærd, kan de holdes i køleskabet i flere uger, men de skal fodres. Hver flere dage skal sommerfuglene tages ud for at blive fodret med en fortyndet honningvandopløsning. Under indendørs belysning kan dette gøres ved at bruge en nål til at rulle deres proboscis ud i maden. I slutningen af voksenpræstationen kan der træffes en bred vifte af fitnessforanstaltninger på kålhvide sommerfugle. Kropsstørrelse kan måles som den våde eller tørre masse af larver på bestemte stadier, pupper eller voksne (ofret eller holdt i glassinhylstre) eller ved måling af vingelængde i programmet ImageJ (se 12,24,25,28). Hunnernes livstidsfrugtbarhed kan måles gennem daglige ægsamlinger på værtsplanter 25,69,70, og størrelsen af specifikke træk kan måles som en præstationsmåling; For eksempel massen eller volumenet af hjernen eller de enkelte hjerneområder 62,71,72 eller masse- eller proteinindholdet i brystkassen eller flyvemusklen 62,70. Endelig kan voksne bruges i adfærdsstudier til at teste et vilkårligt antal spørgsmål, der undersøger effekten af diætmanipulation på foder eller ovipositionsvalg27,73.
Hvis opdrætsprotokollen ikke fungerer som forventet, er der et par aspekter, der skal fejlløses. For det første kan man spørge, om lysniveauerne er høje nok til at fremkalde normal voksenadfærd. Mens laboratorietilpassede linjer af Pieris vil lægge æg under fluorescerende lys, er det eneste kunstige lys, der fungerer for vildtypelinjer, kraftige bredspektrede drivhuslys. Naturligt lys i drivhuse, vindueskarme eller udendørs fungerer bedst for at fremkalde parring og æglægningsadfærd. For det andet, hvis æg ikke klækkes, eller hvis larver dør tidligt i udviklingen, er der et par ting at overveje. Værtsplantematerialet skal være økologisk, idet det bemærkes, at “økologiske” planter fra butikker undertiden behandles med kemikalier, der kan dræbe larver, så det er ofte bedst at opdrætte ens egne værtsplanter. Hvis værtsacceptraten er lavere, kan yngre blade med højere kvælstofindhold forsøges, præsentere potteplanter i stedet for individuelle blade og sikre, at hunner parres. Kvinder accepterer såning af Brassica, selv små spirer, der er 2 uger gamle. Paraffinmetoden fungerer godt til at overføre æg til forskellige forhold, men det skal bemærkes, at acceptraten har tendens til at være lavere end hele planter. For det tredje skal alle komponenter i kosten være af høj kvalitet og ikke udløbet. Hørfrøolie bør udskiftes årligt og opbevares i køleskabet24,25. Hvedekim, vitaminblandingen og antibiotika bør også holdes kølige. For det fjerde kan man overveje at justere opsætningen af kostkoppen. Et vilkårligt antal engangsplastkoptyper kan bruges til opdræt, fra 1 oz til 15 oz. Vi har fundet ud af, at 4 oz er en god størrelse til at give mulighed for voksen fremkomst og pakker pænt ind i vores klimakamre. Huller, der stikkes i lågene, giver mulighed for luftstrøm, men for mange huller kan tørre kosten under forhold med lav luftfugtighed, så dette tal skal muligvis justeres. For det femte skal forholdene i klimakammeret muligvis justeres i kombination med kopforholdene. Hvis forholdene er for tørre, kan værtsplanter med æg tørre ud, før larver kan overføres, og kopper med kost kan tørre ud, før sommerfugle dukker op. På den anden side, hvis forholdene er for våde, kan kopperne rumme skimmel og sygdom. Forskere skal muligvis justere luftstrømmen i kopper ved hjælp af netlåg eller mere eller mindre huller i lågene. Et andet almindeligt problem er kammerlys, der er lyse nok til at forårsage temperatursvingninger i kopperne og opbygning af kondens; Brug af lysdæmpere er en nem mulighed for larveopdræt.
Med hensyn til forskningsspørgsmålene i dette papir fandt denne undersøgelse, at kålhvide var relativt mere følsomme over for kobber end nikkel eller zink. Kobber havde signifikant negativ indvirkning på udviklingstiden ved koncentrationer så lave som 50 ppm (figur 3 og tabel 3) og på overlevelse ved 500 ppm (figur 4, tabel 4). I modsætning hertil var der ingen negative virkninger af nikkel på overlevelsen (op til 500 ppm; Figur 3) eller negative virkninger på udviklingstiden ved 100 ppm (figur 4). Kålhvide var ret tolerante over for zink, med overlevelseseffekter set kun ved 1.000 ppm (figur 3) og negative virkninger på udviklingstid startende ved 100 ppm (figur 4). Baseret på de relativt større koncentrationer af zink i sommerfuglevæv og sennep (deres værtsplante; Figur 1), forventedes det, at der ville blive set en relativt større tolerance over for zink. Imidlertid var følsomheden over for kobber og tolerancen for nikkel noget uventet i betragtning af de meget lave niveauer af nikkel i sommerfuglevæv (figur 1) og nødvendigheden af kobber som mikronæringsstof. Disse uventede fund diskuteres nedenfor efter at have overvejet tolerancen for disse metaller i andre sommerfugle og møller.
For at sammenligne de nuværende data med metalfølsomhed målt i andre Lepidoptera blev der udarbejdet data fra eksisterende undersøgelser om minimumskoncentrationen, hvor tungmetaller negativt påvirkede overlevelsen 49,50,51,56,63,64,65,66,67,68; disse undersøgelser fokuserede på møl, især skadedyrsarter (Galleria mellonella, Lymantria dispar, Plutella xylostella, Spodoptera sp.). Alle de målte følsomhedsværdier i denne undersøgelse ligger tæt på det interval, der er målt for disse andre arter (figur 5). Imidlertid synes målet for nikkeltolerance i denne undersøgelse at være højere end forventet – mens der ikke var en signifikant effekt af overlevelse ved 500 ppm, fandt den tidligere undersøgelse af Pieris rapae også en meget høj tolerance for nikkel (signifikante virkninger startende ved 1.000 ppm56) på trods af lave niveauer i deres væv naturligt (figur 1). Målingen af kobberfølsomhed i denne undersøgelse synes også at være i den lave ende for undersøgelser af Lepidoptera. Mens brugen af en kunstig diæt tillader en bekvem og kontrolleret sammenligning af relativ metalfølsomhed, er det vigtigt at bemærke, at komponenter i kosten kan ændre målingen af absolut metalfølsomhed. For eksempel kan C-vitamin i kosten opveje metalinduceret oxidativt stress74, eller antibiotika i kosten kan ændre eventuelle virkninger af mikrober på behandlingen af metaller75. En interessant linje i fremtidig forskning ville være systematisk at manipulere sådanne diætkomponenter for at teste effekter på metaltoksicitet, især givet spørgsmål om den funktionelle rolle af lepidopteran tarmmikrober 76,77 og nektarkomponenter, der kan have antioxidantegenskaber78. Desuden kan variation i kostbehov på tværs af arter gøre interspecifikke sammenligninger udfordrende, og kunstige kostbaserede metoder bør suppleres med manipulationer af værtsplanter.
Disse sommerfugle er særligt tolerante over for nikkel og følsomme over for kobber. Tidligere forskning har bemærket, at mange planter i sennepsfamilien, som omfatter planter begunstiget af Pieridae, hyperakkumulerer nikkel som en defensiv mekanisme mod planteædere 55,56,63,79,80,81. Denne hyperakkumulering er over 1.000 ppm i plantevæv, hvilket er størrelsesordener større end hvad der ses i de fleste planter (figur 1). Det er muligt, at Pieris har en særlig høj tolerance for nikkel på grund af tidligere udvælgelse af sådanne nikkelakkumulatorer, som tidligere spekuleret26. Mens kobber er blevet mindre hyppigt undersøgt som et mikronæringsstof i insektdiet, er der nogle tegn på, at det spiller en lille rolle i reproduktion og immunitet, skønt primært i blodfødende insekter (f.eks. 82,83). Det er muligt, at kobber spiller en mindre vigtig fysiologisk rolle i sommerfugle end hos andre dyr 84,85,86, i overensstemmelse med nyere arbejde, der fremhæver, hvordan kobber kan være så bekymrende for et forurenende stof for insekter som bly, cadmium og kviksølv (f.eks. 87,88,89). Mens Pieris har vist sig at undgå kobberforurening ved lave niveauer90, har kobberets mobilitet i planter (f.eks. Flytning til blade og blomster) også markeret det som et metalforurenende stof af bekymring91.
Mens disse resultater giver interessante data om disse metallers relative toksicitet for kålhvide sommerfugle, sigter dette papir også mod at være til generel brug som en detaljeret visuel illustration af metoder til opdræt af dette kraftfulde system. Kålhvide er lette at opdrætte og manipulere i kontrollerede laboratorieeksperimenter 4,5, hvilket letter undersøgelser af værtssøgning 6,7,8, fouragering9,10,11 og seksuel selektion12,13,14. Evnen til at opdrætte disse sommerfugle på en kunstig diæt er nøglen til at skabe fælles haveforhold til sammenligninger og manipulere næringsstoffer, toksiner og endda nye værtsplanter. Det er dog vigtigt at bemærke, at denne kunstige diæt ikke nødvendigvis er den optimale kunstige diæt for denne art og sandsynligvis kan forbedres med fremtidige manipulationer. For eksempel blev saltblandingen i denne diæt (og andre lepidopteranske diæter) oprindeligt udviklet til hvirveldyr og har højere calciumniveauer end hvad de fleste insekter har brug for92,93. Således har nogle af vores opdrætsbestræbelser lavet brugerdefinerede saltblandinger med lavere calciumniveauer (f.eks. 62), og andre gør brug af “Becks saltblanding”, hvilket kan være mere passende for mange insektarter94. I vores egne manipulationer fandt vi også, at sommerfugle klarede sig bedre med relativt mindre hvedekim og relativt mere cellulose sammenlignet med oprindelige koncentrationer4. Et område, der kræver yderligere opmærksomhed, er lipidkilden og koncentrationen i kosten. For eksempel har tidligere arbejde vist, at skift fra linolie (anvendt i denne undersøgelse) til fosfolipider øgede parringshastigheder og vækstrater for Pieris på kunstige kostvaner95. Tilskud af specifikke fedtsyrer i kunstige kostvaner kan have yderligere positive virkninger96,97. Optimering af den kunstige kost af Pieris98,99 skaber muligheder for at løse interessante spørgsmål om ernæringsøkologi 100,101,102, evolutionær økologi og økotoksikologi. Disse kunstige diætmetoder giver forskere mulighed for at behandle spørgsmål om specifikke lipiders rolle i kognitiv evolution 103, prætilpasning til toksiner28, kostkomponenter, der reducerer toksiciteten af forurenende stoffer 104 eller støkiometriske interaktioner mellem næringsstoffer105.
The authors have nothing to disclose.
Vi er taknemmelige for støtten fra bachelorassistenter under opdragelsen til dette arbejde, især Regina Kurandina og Rhea Smykalski. Carolyn Kalinowski hjalp med at udarbejde litteratur om metaltoksicitet i andre Lepidoptera. Dette arbejde blev muliggjort af et sommerforskningsstipendium fra University of Minnesota Department of Ecology, Evolution and Behavior.
1-L Pyrex beaker | Fisher Scientific | 07-250-059 | |
500 mL graduated cylinder | Fisher Scientific | 03-007-43 | |
60-mm plastic petri dish lid | Fisher Scientific | 08-757-100B | |
Ascorbic Acid | Frontier | 6015 | |
Blender | Amazon – Ninja Store | BL610 Professional | |
Cabbage Flour | Frontier | 1086 | |
Casein | Frontier | 1100 | |
Celluose | Frontier | 3425 | |
Cholsterol | Sigma | C3045 | |
Cups for rearing (4 oz) | Wasserstrom | 6094583 | purchase with matching lids |
Fine Mesh Agar | Sigma | ||
Flaxseed Oil | amazon | B004R63VI6 | |
Floral water tubes, 2.8 x 0.8inch | Amazon – Yimaa Direct | B08BZ969DK | |
Glassine envelopes (1 3/4 x 2 7/8 INCHES) | Amazon – Wizard Coin Supply | B0045FG90G | |
Mesh Cages (15.7 x 15.7 x 23.6") | Amazon | B07SK6P94S | |
Methyl Paraben | Frontier | 7685 | |
Ohaus Portable Scale | Fisher Scientific | 02-112-228 | |
Organic Honey | Amazon | B07DHQQFGM | |
Photo studio portable lightbox | Amazon | B07T6TNYJ1 | |
Plastic bin, shoebox size | Amazon | B09L3B3V1R | |
Plastic disposable transfer pipets | Fisher Scientific | 13-680-50 | |
Sorbic Acid | Sigma | S1626 | |
Spatulas | Fisher Scientific | 14-357Q | |
Streptomycin | Sigma | S9137 | |
Sucrose | Target | ||
Torula Yeast | Frontier | 1720 | |
Vanderzant vitamin mix | Frontier | F8045 | |
Weigh boats | Fisher Scientific | 01-549-750 | |
Wesson Salt Mix | Frontier | F8680 | |
Wheat Germ | Frontier | G1659 | |
Wooden handled butterfly net, 12" hoop | Amazon – Educational Science | B00O5JDLVC | |
Yellow sponges | Amazon-Celox | B0B8HTHY5B |