ex vivo-forberedelse af rygmarvsskive til helcelle-patch-clamp-optagelse i motorneuroner under rygmarvsstimulering
Summary
Denne protokol beskriver en metode, der bruger en patch-clamp til at studere de elektriske reaktioner fra motorneuroner til rygmarvsstimulering (SCS) med høj rumlig tidsmæssig opløsning, hvilket kan hjælpe forskere med at forbedre deres færdigheder i at adskille rygmarven og opretholde cellelevedygtighed samtidigt.
Abstract
Rygmarvsstimulering (SCS) kan effektivt genoprette lokomotorisk funktion efter rygmarvsskade (SCI). Fordi motorneuronerne er den sidste enhed til at udføre sensorimotorisk adfærd, kan direkte undersøgelse af de elektriske reaktioner fra motorneuroner med SCS hjælpe os med at forstå den underliggende logik i spinalmotormodulation. For samtidig at registrere forskellige stimulusegenskaber og cellulære reaktioner er en patch-clamp en god metode til at studere de elektrofysiologiske egenskaber på en enkeltcelleskala. Der er dog stadig nogle komplekse vanskeligheder med at nå dette mål, herunder opretholdelse af cellelevedygtighed, hurtig adskillelse af rygmarven fra knoglestrukturen og brug af SCS til succesfuldt at fremkalde handlingspotentialer. Her præsenterer vi en detaljeret protokol ved hjælp af patch-clamp til at studere de elektriske reaktioner fra motorneuroner til SCS med høj rumlig tidsmæssig opløsning, hvilket kan hjælpe forskere med at forbedre deres færdigheder i at adskille rygmarven og opretholde cellelevedygtigheden på samme tid for jævnt at studere SCS’s elektriske mekanisme på motorneuron og undgå unødvendige forsøg og fejl.
Introduction
Rygmarvsstimulering (SCS) kan effektivt genoprette lokomotorisk funktion efter rygmarvsskade (SCI). Andreas Rowald et al. rapporterede, at SCS muliggør lokomotorisk og kropslig funktion i underekstremiteterne inden for en enkelt dag1. Udforskning af SCS’ biologiske mekanisme til lokomotorisk genopretning er et kritisk og trendende forskningsfelt for udvikling af en mere præcis SCS-strategi. For eksempel demonstrerede Grégoire Courtines team, at excitatoriske Vsx2-interneuron og Hoxa10-neuroner i rygmarven er nøgleneuronerne til respons på SCS, og cellespecifik neuromodulation er mulig for at genoprette rottegangsevnen efter SCI2. Imidlertid fokuserer få undersøgelser på den elektriske mekanisme i SCS på en enkeltcelleskala. Selvom det er velkendt, at suprathreshold jævnstrømsstimulus kan fremkalde handlingspotentialerne (AP’er) i det klassiske blæksprutteeksperiment 3,4,5, er det stadig uklart, hvordan den pulserende vekslende elektriske stimulering, såsom SCS, påvirker motorsignalgenereringen.
I betragtning af kompleksiteten af intraspinale neurale kredsløb er passende selektion for cellepopulation vigtig for at undersøge SCS’s elektriske mekanisme. Selvom SCS genopretter motorfunktionen ved at aktivere den proprioceptive vej6, er motorneuronerne den sidste enhed til at udføre motorkommandoen, afledt af integration af proprioceptionsinformation afferent input7. Derfor kan direkte undersøgelse af de elektriske egenskaber ved motorneuroner med SCS hjælpe os med at forstå den underliggende logik i spinalmotormodulation.
Som vi ved, er patch-clamp den gyldne standardmetode til cellulær elektrofysiologisk optagelse med ekstremt høj spatiotemporal opløsning8. Derfor beskriver denne undersøgelse en metode, der bruger en patchklemme til at studere motorneuronernes elektriske reaktioner på SCS. Sammenlignet med hjerneplaster9 er rygmarvsplasterklemmen vanskeligere af følgende årsager: (1) Rygmarven er beskyttet af rygsøjlen med lille volumen, hvilket kræver meget fin mikromanipulation og streng iskold vedligeholdelse for at opnå bedre cellelevedygtighed. (2) Da rygmarven er for slank til at blive fastgjort på skærebakken, bør den nedsænkes i agarose med lavt smeltepunkt og trimmes efter størkning.
Derfor giver denne metode tekniske detaljer ved dissekering af rygmarven og opretholdelse af cellelevedygtigheden på samme tid for jævnt at studere SCS’s elektriske mekanisme på motorneuroner og undgå unødvendige forsøg og fejl.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bevægelsesinformationen moduleret af SCS konvergeres endelig til motorneuronerne. Derfor kan det at tage motorneuronerne som forskningsmål forenkle undersøgelsesdesignet og afsløre neuromodulationsmekanismen for SCS mere direkte. For samtidig at registrere forskellige stimulusegenskaber og cellulære reaktioner er en patch-clamp en god metode til at studere de elektrofysiologiske egenskaber på en enkeltcelleskala. Der er dog stadig nogle vanskeligheder, herunder hvordan man opretholder cellelevedygtighed, hvordan ma…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne undersøgelse blev finansieret af National Natural Science Foundation of China for Young Scholars (52207254 og 82301657) og China Postdoctoral Science Fund (2022M711833).
Materials
| Adenosine 5’-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4034 | |
| CaCl2·2H2O | Sigma | C5080 | |
| Choline Chloride | Sigma | C7527 | |
| Cover slide tweezers | VETUS | 36A-SA | Clip a slice |
| D-Glucose | Sigma | G8270 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Fine scissors | RWD Life Science | S12006-10 | Cut the diaphragm |
| Fluorescence Light Source | Olympus | U-HGLGPS | |
| Fluoro-Gold | Fluorochrome | Fluorochrome | Label the motor neuron |
| Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma | G8877 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| infrared CCD camera | Dage-MTI | IR-1000E | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| K-gluconate | Sigma | P1847 | |
| Low melting point agarose | Sigma | A9414 | |
| MgSO4·7H2O | Sigma | M2773 | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-200 | |
| Micropipette puller | Sutter instrument | P1000 | |
| Micro-scissors | Jinzhong | wa1020 | Laminectomy |
| Microscope for anatomy | Olympus | SZX10 | |
| Microscope for ecletrophysiology | Olympus | BX51WI | |
| Micro-toothed tweezers | RWD Life Science | F11008-09 | Lift the cut vertebral body |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | |
| NaHCO3 | Sigma | V900182 | |
| Na-Phosphocreatine | Sigma | P7936 | |
| Objective lens for ecletrophysiology | Olympus | LUMPLFLN60XW | working distance 2 mm |
| Osmometer | Advanced | FISKE 210 | |
| Patch-clamp amplifier | Axon | Multiclamp 700B | |
| Patch-clamp digitizer | Axon | Digidata 1550B | |
| pH meter | Mettler Toledo | FE28 | |
| Slice Anchor | Multichannel system | SHD-27H | |
| Spinal cord stimulatior | PINS | T901 | |
| Toothed tweezer | RWD Life Science | F13030-10 | Lift the xiphoid |
| Vibratome | Leica | VT1200S | |
| Wide band ultraviolet excitation filter | Olympus | U-MF2 |
Referências
- Rowald, A., et al. Activity-dependent spinal cord neuromodulation rapidly restores trunk and leg motor functions after complete paralysis. Nature Medicine. 28 (2), 260-271 (2022).
- Kathe, C., et al. The neurons that restore walking after paralysis. Nature. 611 (7936), 540-547 (2022).
- Smith, S. J., Buchanan, J., Osses, L. R., Charlton, M. P., Augustine, G. J. The spatial distribution of calcium signals in squid presynaptic terminals. The Journal of Physiology. 472, 573-593 (1993).
- Augustine, G. J. Regulation of transmitter release at the squid giant synapse by presynaptic delayed rectifier potassium current. The Journal of Physiology. 431, 343-364 (1990).
- Llinás, R., McGuinness, T. L., Leonard, C. S., Sugimori, M., Greengard, P. Intraterminal injection of synapsin I or calcium/calmodulin-dependent protein kinase II alters neurotransmitter release at the squid giant synapse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (9), 3035-3039 (1985).
- Formento, E., et al. Electrical spinal cord stimulation must preserve proprioception to enable locomotion in humans with spinal cord injury. Nature Neuroscience. 21 (12), 1728-1741 (2018).
- Hari, K., et al. GABA facilitates spike propagation through branch points of sensory axons in the spinal cord. Nature Neuroscience. 25 (10), 1288-1299 (2022).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Review Of Physiology. 46, 455-472 (1984).
- Leroy, F., Lamotte d’Incamps, B. The preparation of oblique spinal cord slices for ventral root stimulation. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (116), e54525 (2016).
- Sharples, S. A., Miles, G. B. Maturation of persistent and hyperpolarization-activated inward currents shapes the differential activation of motoneuron subtypes during postnatal development. Elife. 10, e71385 (2021).
- Bhumbra, G. S., Beato, M. Recurrent excitation between motoneurones propagates across segments and is purely glutamatergic. PLoS Biology. 16 (3), e2003586 (2018).
- Leroy, F., Lamotte d’Incamps, B., Imhoff-Manuel, R. D., Zytnicki, D. Early intrinsic hyperexcitability does not contribute to motoneuron degeneration in amyotrophic lateral sclerosis. Elife. 3, 04046 (2014).
- Tahir, R. A., Pabaney, A. H. Therapeutic hypothermia and ischemic stroke: A literature review. Surgical Neurology International. 7, S381-S386 (2016).
- Lu, Y., et al. Management of intractable pain in patients with implanted spinal cord stimulation devices during the COVID-19 pandemic using a remote and wireless programming system. Frontiers in Neuroscience. 14, 594696 (2020).
- Yao, Q., et al. Wireless epidural electrical stimulation in combination with serotonin agonists improves intraspinal metabolism in spinal cord injury rats. Neuromodulation. 24 (3), 416-426 (2021).
- Arlotti, M., Rahman, A., Minhas, P., Bikson, M. Axon terminal polarization induced by weak uniform dc electric fields: a modeling study. 2012 Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. , 4575-4578 (2012).
- Espino, C. M., et al. Na(V)1.1 is essential for proprioceptive signaling and motor behaviors. Elife. 11, e79917 (2022).
- Romer, S. H., Deardorff, A. S., Fyffe, R. E. W. A molecular rheostat: Kv2.1 currents maintain or suppress repetitive firing in motoneurons. The Journal of Physiology. 597 (14), 3769-3786 (2019).
- Yao, X., et al. Structures of the R-type human Ca(v)2.3 channel reveal conformational crosstalk of the intracellular segments. Nature Communications. 13 (1), 7358 (2022).
- Bandres, M. F., Gomes, J., McPherson, J. G. Spontaneous multimodal neural transmission suggests that adult spinal networks maintain an intrinsic state of readiness to execute sensorimotor behaviors. Journal Of Neuroscience. 41 (38), 7978-7990 (2021).
- Manuel, M., Heckman, C. J. Simultaneous intracellular recording of a lumbar motoneuron and the force produced by its motor unit in the adult mouse in vivo. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (70), e4312 (2012).
- Luo, X., Wang, S., Rutkove, S. B., Sanchez, B. Nonhomogeneous volume conduction effects affecting needle electromyography: an analytical and simulation study. Physiological Measurement. 42 (11), (2021).
- Barra, B., et al. Epidural electrical stimulation of the cervical dorsal roots restores voluntary upper limb control in paralyzed monkeys. Nature Neuroscience. 25 (7), 924-934 (2022).
- Powell, M. P., et al. Epidural stimulation of the cervical spinal cord for post-stroke upper-limb paresis. Nature Medicine. 29 (3), 689-699 (2023).
- Wenger, N., et al. Spatiotemporal neuromodulation therapies engaging muscle synergies improve motor control after spinal cord injury. Nature Medicine. 22 (2), 138-145 (2016).
- Özyurt, M. G., Ojeda-Alonso, J., Beato, M., Nascimento, F. In vitro longitudinal lumbar spinal cord preparations to study sensory and recurrent motor microcircuits of juvenile mice. Journal of Neurophysiology. 128 (3), 711-726 (2022).
- Moraud, E. M., et al. Mechanisms underlying the neuromodulation of spinal circuits for correcting gait and balance deficits after spinal cord injury. Neuron. 89 (4), 814-828 (2016).
- Capogrosso, M., et al. A computational model for epidural electrical stimulation of spinal sensorimotor circuits. Journal of Neuroscience. 33 (49), 19326-19340 (2013).
