Ex vivo-beredning av ryggmärgsskiva för helcellspatch-clamp-registrering i motorneuroner under ryggmärgsstimulering
Summary
Detta protokoll beskriver en metod som använder en patch-clamp för att studera de motoriska nervcellernas elektriska svar på ryggmärgsstimulering (SCS) med hög spatiotemporal upplösning, vilket kan hjälpa forskare att förbättra sina färdigheter i att separera ryggmärgen och upprätthålla cellviabilitet samtidigt.
Abstract
Ryggmärgsstimulering (SCS) kan effektivt återställa rörelsefunktionen efter ryggmärgsskada. Eftersom de motoriska nervcellerna är den sista enheten för att utföra sensomotoriska beteenden, kan direkta studier av de elektriska svaren hos motorneuroner med SCS hjälpa oss att förstå den underliggande logiken för ryggradsmotorisk modulering. För att samtidigt registrera olika stimulusegenskaper och cellulära svar är en patch-clamp en bra metod för att studera de elektrofysiologiska egenskaperna på encellsskala. Det finns dock fortfarande några komplexa svårigheter för att uppnå detta mål, inklusive att upprätthålla cellviabiliteten, snabbt separera ryggmärgen från den beniga strukturen och använda SCS för att framgångsrikt inducera aktionspotentialer. Här presenterar vi ett detaljerat protokoll med hjälp av patch-clamp för att studera de elektriska svaren hos motorneuroner på SCS med hög spatiotemporal upplösning, vilket kan hjälpa forskare att förbättra sina färdigheter i att separera ryggmärgen och upprätthålla cellviabiliteten samtidigt som de smidigt studerar den elektriska mekanismen för SCS på motorneuron och undviker onödiga försök och misstag.
Introduction
Ryggmärgsstimulering (SCS) kan effektivt återställa rörelsefunktionen efter ryggmärgsskada. Andreas Rowald et al. rapporterade att SCS möjliggör rörelse- och bålfunktion i nedre extremiteter inom en enda dag1. Att utforska den biologiska mekanismen för SCS för motorisk återhämtning är ett kritiskt och trendigt forskningsområde för att utveckla en mer exakt SCS-strategi. Till exempel visade Grégoire Courtines team att excitatoriska Vsx2-interneuron och Hoxa10-neuroner i ryggmärgen är de viktigaste neuronerna för att svara på SCS, och cellspecifik neuromodulering är möjlig för att återställa råttans gångförmåga efter SCI2. Få studier fokuserar dock på den elektriska mekanismen för SCS på encellsskala. Även om det är välkänt att supratröskeln likströmsstimulus kan framkalla aktionspotentialerna (AP) i det klassiska bläckfiskexperimentet 3,4,5, är det fortfarande oklart hur den pulserande växelströmsstimuleringen, såsom SCS, påverkar motorsignalgenereringen.
Med tanke på komplexiteten hos intraspinala neurala kretsar är lämpligt urval för cellpopulationen viktigt för att undersöka den elektriska mekanismen för SCS. Även om SCS återställer motorisk funktion genom att aktivera den proprioceptiva vägen6, är de motoriska nervcellerna den slutliga enheten för att utföra det motoriska kommandot, härlett från att integrera proprioceptionsinformation afferent input7. Att direkt studera de elektriska egenskaperna hos motorneuroner med SCS kan därför hjälpa oss att förstå den underliggande logiken för spinal motorisk modulering.
Som vi vet är patch-clamp den gyllene standardmetoden för cellulärt elektrofysiologisk inspelning med extremt hög spatiotemporal upplösning8. Därför beskriver denna studie en metod som använder en patch clamp för att studera de elektriska svaren hos motorneuroner på SCS. Jämfört med hjärnklämma9 är ryggmärgsklämman svårare på grund av följande skäl: (1) Ryggmärgen skyddas av kotkanalen med liten volym, vilket kräver mycket fin mikromanipulation och rigoröst iskallt underhåll för att få bättre cellviabilitet. (2) Eftersom ryggmärgen är för smal för att fästas på skärbrickan, bör den nedsänkas i agaros med låg smältpunkt och trimmas efter stelning.
Därför ger denna metod tekniska detaljer för att dissekera ryggmärgen och samtidigt upprätthålla cellviabiliteten för att smidigt studera den elektriska mekanismen för SCS på motorneuroner och undvika onödiga försök och misstag.
Protocol
Representative Results
Discussion
Rörelseinformationen som moduleras av SCS konvergerar slutligen till de motoriska nervcellerna. Att ta de motoriska nervcellerna som forskningsmål kan därför förenkla studiedesignen och avslöja neuromoduleringsmekanismen för SCS mer direkt. För att samtidigt registrera olika stimulusegenskaper och cellulära svar är en patch-clamp en bra metod för att studera de elektrofysiologiska egenskaperna på encellsskala. Det finns dock fortfarande vissa svårigheter, bland annat hur man upprätthåller cellviabiliteten,…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie finansierades av National Natural Science Foundation of China for Young Scholars (52207254 och 82301657) och China Postdoctoral Science Fund (2022M711833).
Materials
| Adenosine 5’-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4034 | |
| CaCl2·2H2O | Sigma | C5080 | |
| Choline Chloride | Sigma | C7527 | |
| Cover slide tweezers | VETUS | 36A-SA | Clip a slice |
| D-Glucose | Sigma | G8270 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Fine scissors | RWD Life Science | S12006-10 | Cut the diaphragm |
| Fluorescence Light Source | Olympus | U-HGLGPS | |
| Fluoro-Gold | Fluorochrome | Fluorochrome | Label the motor neuron |
| Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma | G8877 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| infrared CCD camera | Dage-MTI | IR-1000E | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| K-gluconate | Sigma | P1847 | |
| Low melting point agarose | Sigma | A9414 | |
| MgSO4·7H2O | Sigma | M2773 | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-200 | |
| Micropipette puller | Sutter instrument | P1000 | |
| Micro-scissors | Jinzhong | wa1020 | Laminectomy |
| Microscope for anatomy | Olympus | SZX10 | |
| Microscope for ecletrophysiology | Olympus | BX51WI | |
| Micro-toothed tweezers | RWD Life Science | F11008-09 | Lift the cut vertebral body |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | |
| NaHCO3 | Sigma | V900182 | |
| Na-Phosphocreatine | Sigma | P7936 | |
| Objective lens for ecletrophysiology | Olympus | LUMPLFLN60XW | working distance 2 mm |
| Osmometer | Advanced | FISKE 210 | |
| Patch-clamp amplifier | Axon | Multiclamp 700B | |
| Patch-clamp digitizer | Axon | Digidata 1550B | |
| pH meter | Mettler Toledo | FE28 | |
| Slice Anchor | Multichannel system | SHD-27H | |
| Spinal cord stimulatior | PINS | T901 | |
| Toothed tweezer | RWD Life Science | F13030-10 | Lift the xiphoid |
| Vibratome | Leica | VT1200S | |
| Wide band ultraviolet excitation filter | Olympus | U-MF2 |
Referências
- Rowald, A., et al. Activity-dependent spinal cord neuromodulation rapidly restores trunk and leg motor functions after complete paralysis. Nature Medicine. 28 (2), 260-271 (2022).
- Kathe, C., et al. The neurons that restore walking after paralysis. Nature. 611 (7936), 540-547 (2022).
- Smith, S. J., Buchanan, J., Osses, L. R., Charlton, M. P., Augustine, G. J. The spatial distribution of calcium signals in squid presynaptic terminals. The Journal of Physiology. 472, 573-593 (1993).
- Augustine, G. J. Regulation of transmitter release at the squid giant synapse by presynaptic delayed rectifier potassium current. The Journal of Physiology. 431, 343-364 (1990).
- Llinás, R., McGuinness, T. L., Leonard, C. S., Sugimori, M., Greengard, P. Intraterminal injection of synapsin I or calcium/calmodulin-dependent protein kinase II alters neurotransmitter release at the squid giant synapse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (9), 3035-3039 (1985).
- Formento, E., et al. Electrical spinal cord stimulation must preserve proprioception to enable locomotion in humans with spinal cord injury. Nature Neuroscience. 21 (12), 1728-1741 (2018).
- Hari, K., et al. GABA facilitates spike propagation through branch points of sensory axons in the spinal cord. Nature Neuroscience. 25 (10), 1288-1299 (2022).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Review Of Physiology. 46, 455-472 (1984).
- Leroy, F., Lamotte d’Incamps, B. The preparation of oblique spinal cord slices for ventral root stimulation. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (116), e54525 (2016).
- Sharples, S. A., Miles, G. B. Maturation of persistent and hyperpolarization-activated inward currents shapes the differential activation of motoneuron subtypes during postnatal development. Elife. 10, e71385 (2021).
- Bhumbra, G. S., Beato, M. Recurrent excitation between motoneurones propagates across segments and is purely glutamatergic. PLoS Biology. 16 (3), e2003586 (2018).
- Leroy, F., Lamotte d’Incamps, B., Imhoff-Manuel, R. D., Zytnicki, D. Early intrinsic hyperexcitability does not contribute to motoneuron degeneration in amyotrophic lateral sclerosis. Elife. 3, 04046 (2014).
- Tahir, R. A., Pabaney, A. H. Therapeutic hypothermia and ischemic stroke: A literature review. Surgical Neurology International. 7, S381-S386 (2016).
- Lu, Y., et al. Management of intractable pain in patients with implanted spinal cord stimulation devices during the COVID-19 pandemic using a remote and wireless programming system. Frontiers in Neuroscience. 14, 594696 (2020).
- Yao, Q., et al. Wireless epidural electrical stimulation in combination with serotonin agonists improves intraspinal metabolism in spinal cord injury rats. Neuromodulation. 24 (3), 416-426 (2021).
- Arlotti, M., Rahman, A., Minhas, P., Bikson, M. Axon terminal polarization induced by weak uniform dc electric fields: a modeling study. 2012 Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. , 4575-4578 (2012).
- Espino, C. M., et al. Na(V)1.1 is essential for proprioceptive signaling and motor behaviors. Elife. 11, e79917 (2022).
- Romer, S. H., Deardorff, A. S., Fyffe, R. E. W. A molecular rheostat: Kv2.1 currents maintain or suppress repetitive firing in motoneurons. The Journal of Physiology. 597 (14), 3769-3786 (2019).
- Yao, X., et al. Structures of the R-type human Ca(v)2.3 channel reveal conformational crosstalk of the intracellular segments. Nature Communications. 13 (1), 7358 (2022).
- Bandres, M. F., Gomes, J., McPherson, J. G. Spontaneous multimodal neural transmission suggests that adult spinal networks maintain an intrinsic state of readiness to execute sensorimotor behaviors. Journal Of Neuroscience. 41 (38), 7978-7990 (2021).
- Manuel, M., Heckman, C. J. Simultaneous intracellular recording of a lumbar motoneuron and the force produced by its motor unit in the adult mouse in vivo. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (70), e4312 (2012).
- Luo, X., Wang, S., Rutkove, S. B., Sanchez, B. Nonhomogeneous volume conduction effects affecting needle electromyography: an analytical and simulation study. Physiological Measurement. 42 (11), (2021).
- Barra, B., et al. Epidural electrical stimulation of the cervical dorsal roots restores voluntary upper limb control in paralyzed monkeys. Nature Neuroscience. 25 (7), 924-934 (2022).
- Powell, M. P., et al. Epidural stimulation of the cervical spinal cord for post-stroke upper-limb paresis. Nature Medicine. 29 (3), 689-699 (2023).
- Wenger, N., et al. Spatiotemporal neuromodulation therapies engaging muscle synergies improve motor control after spinal cord injury. Nature Medicine. 22 (2), 138-145 (2016).
- Özyurt, M. G., Ojeda-Alonso, J., Beato, M., Nascimento, F. In vitro longitudinal lumbar spinal cord preparations to study sensory and recurrent motor microcircuits of juvenile mice. Journal of Neurophysiology. 128 (3), 711-726 (2022).
- Moraud, E. M., et al. Mechanisms underlying the neuromodulation of spinal circuits for correcting gait and balance deficits after spinal cord injury. Neuron. 89 (4), 814-828 (2016).
- Capogrosso, M., et al. A computational model for epidural electrical stimulation of spinal sensorimotor circuits. Journal of Neuroscience. 33 (49), 19326-19340 (2013).
