Detta protokoll beskriver skörd och visualisering av elasmoidfjäll hos zebrafiskar under in vivo-regenerering . Dessutom presenteras ex vivo-odlingen av dessa skalor i upp till 7 dagar efter skörden.
Skelettsjukdomar är ofta komplexa i sin etiologi och drabbar miljontals människor världen över. På grund av den åldrande befolkningen finns det ett behov av nya behandlingar som kan minska belastningen på hälso- och sjukvårdssystemen. Eftersom dessa sjukdomar är komplexa är det svårt och dyrt att exakt modellera benpatofysiologin i en laboratoriemiljö. Utmaningen för fältet är att etablera en kostnadseffektiv, biologiskt relevant plattform för modellering av bensjukdomar som kan användas för att testa potentiella terapeutiska substanser. En sådan plattform bör helst möjliggöra dynamisk visualisering av cellbeteenden hos benbyggande osteoblaster och bennedbrytande osteoklaster som verkar i sin mineraliserade matrismiljö. Zebrafiskar används i allt högre grad som modeller på grund av tillgången till genetiska verktyg, inklusive transgena reporterlinjer, och det faktum att vissa skelettvävnader (inklusive fjällen) förblir genomskinliga till vuxen ålder, vilket möjliggör dynamiska avbildningsalternativ. Eftersom zebrafiskfjäll har både osteoblaster och osteoklaster och är mycket rikliga, ger de en lättillgänglig och rikligt tillgänglig resurs av oberoende benenheter. Dessutom, när de väl har tagits bort, regenereras vuxna zebrafiskfjäll helt, vilket erbjuder ett sätt att studera den spatiotemporala tillväxten av mineraliserad vävnad in vivo. Här beskriver vi protokoll för skörd och spårning av fjällens regenerering. Slutligen presenteras också ett protokoll för stabil odling av skalor ex vivo under en vecka och efter läkningsresponsen efter kontrollerad skada på den mineraliserade matrisen i skalan över tid.
Ben är en hård bindväv som utgör en stor del av skelettet, vilket möjliggör förflyttning och fungerar som en mineralreserv i kroppen. För att bibehålla ett friskt ben är en utsökt balans mellan benbildning och nedbrytning nödvändig via den kopplade aktiviteten hos osteoblaster (som är anabola) och osteoklaster (som resorberar ben). Denna balans störs av åldrande eller hormonell obalans, vilket ofta leder till benskörhetssjukdomar som osteoporos1. Även om befintliga läkemedel har godkänts för att rikta in sig på benskörhetssjukdomar, har många biverkningar; Därför finns det ett behov av nya terapier1. Således finns det fortfarande ett behov av rikliga källor till biologiskt relevant benvävnad som kan användas för att testa potentiella terapeutiska föreningar.
Traditionellt har gnagarmodeller och cellodlingssystem använts för att studera benbiologi. Zebrafiskar blir dock i allt högre grad en annan förebild. Även om zebrafiskar inte är ett däggdjurssystem erbjuder de vissa fördelar för benforskning jämfört med gnagare. Dessa inkluderar deras fruktsamhet och larvernas genomskinlighet; Även i vuxen ålder förblir vissa skelettvävnader, inklusive fjäll och fenor, genomskinliga, vilket möjliggör högupplöst in vivo-avbildning och ökad tillgänglighet av skelettmutanter 2,3. Både zebrafiskens fenor och fjäll kan regenerera sig helt efter att de tagits bort. Skelettregenerering och skadereparation av zebrafiskfenor har studerats utförligt 4,5, medan zebrafiskfjäll är en nyare benmodell i fält men erbjuder fördelar för ex vivo-odling 6.
Fjällen är mycket rikliga, med minst 300 fjäll på varje fisk som fungerar som ett skyddande hölje för fisken. Varje fjäll är en liten mineraliserad platta bestående av benbildande osteoblaster och benresorberande osteoklaster av en kollagenrik skelettmatris7. Förbeningsprocessen hos både zebrafiskfjäll och mänskliga ben kräver differentiering av mesenkymala stamceller till osteoblaster för att bilda den mineraliserade matrisen. Zebrafiskfjäll erbjuder en stor fördel för skelettforskning med sin starka regenerativa förmåga som kan användas för att studera benregenerering och reparation. Men trots närvaron av både osteoblaster och osteoklaster saknar zebrafiskfjäll osteocyter som är viktiga för mänsklig benombyggnad och mekanosensation; Fjällens ytliga placering gör att de enkelt kan tas bort med en pincett. När skalan tas bort inträffar en kaskad av händelser och skalregenerering börjar 8,9. Det finns olika färgnings- och avbildningsalternativ tillgängliga för att visualisera aktiviteten hos osteoblaster och osteoklaster och mineraliseringen av skalorna, som visas i figur 1. Dessutom innebär tillgången på många relevanta fluorescerande transgena reporterlinjer av zebrafiskar att man kan visualisera celldynamik under regenerering 7,10,11. Denna process gör det möjligt att få mer förståelse för de novo-benbildning genom att observera det tidiga mönstret av fjällregenerering på fiskens flank för att studera morfologi, cellulär aktivitet och genetiska profiler hos dessa regenererade fjäll. Skalbildningens och regenereringens biologi har karakteriserats väl. Det är viktigt att notera att fjäll kan visa en god prediktiv förmåga för terapeutiskt relevanta föreningar12 och behandling av fisk med glukokortikoider leder till en skala som regenereras för att visa osteoporotiska fenotyper13. Transkriptomet av de regenererande skalorna visar att gener som aktiveras vid skalregenerering är anrikade för de som är kopplade till mänskliga skelettsjukdomar, vilket ytterligare visar deras relevans som modellsystem 6,14.
Slutligen kan dessa fjäll odlas ex vivo i upp till 7 dagar. Jämfört med cellinjekulturer som vanligtvis består av en enda celltyp, ger odling i ex vivo-skala in vitro-benstudiemöjligheter i sin naturliga miljö som innehåller både osteoblaster och osteoklaster med sin naturliga extracellulära matris 8,12,15,16.
Skalkultur gör det också möjligt för oss att utföra drogscreening för nya osteoanabola mål. Överflödet av fjäll på fisken innebär att man kan fylla minst två plattor av 96-brunnsplattan från bara en enda fisk, vilket möjliggör sammansatt screening i ett multibrunnsformat där varje enskild brunn innehåller en skala tillsammans med dess naturliga nisch av celler. Dessutom, eftersom skalorna är tunna, är läkemedelsabsorptionen förutsägbar12. Sammanfattningsvis har zebrafiskens elasmoidfjäll stor potential inom skelettforskning och kan hjälpa oss att få mer insikt i de cellulära händelserna under benbildning och reparation. Här beskriver vi protokoll för skörd av skalor för att följa föryngring in vivo och odla skalorna ex vivo.
Zebrafiskens elasmoidfjäll, som en ny modell för skelettforskning, har stor potential att hjälpa oss att förstå benunderhåll, regenerering och skadereparation. Överflödet av fjäll på fisk möjliggör screening av föreningar med medelhög till hög genomströmning, samtidigt som antalet djur som används minskar och den inomindividuella variationen begränsas. Här presenteras protokoll för skalregenerering och ex vivo-skalkultur för att studera regenerering och reparation.
Några kritiska steg måste övervägas när du följer detta protokoll. Det är viktigt att försiktigt avlägsna fjällen, särskilt när man använder en transgen reporterlinje för att begränsa störningen av cellpopulationen som orsakas av skörden. Om jämförelser ska göras med ontogenetiska fjäll, se till att regionen inte innehåller spontant regenererande fjäll (som naturligt kan uppstå under fiskens livslängd). Se till att miljön och utrustningen är sterila för ex vivo-odling för att uppnå optimal cellöverlevnad och minimal infektion i odlingen.
Beroende på den specifika forskningsfrågan kan anpassningar göras i protokollet, till exempel genom att kombinera olika transgena reporterlinjer för att visualisera andra celltyper av genuttrycksprofiler under regenerering och reparation11,14.
Det breda utbudet av färgning man kan utföra på vågen innebär att man för varje testad förening eller tillstånd kan titta på dess effekter på benet från olika vinklar; medan sp7/osx-reportrar kan visa osteoblastnummer, ALP-färgning kan visualisera osteoblastaktivitet, TRAP-färgning kan visualisera osteoklastaktivitet, Calcein-grön levande färgning kan märka nybildat ben och Alizarin-röd eller von Kossa-färgning kan visa skalmineralisering. Luciferasaktivitet för att kvantifiera osteoblaster kan också användas12. I kombination med dessa färgningstekniker kan man lära sig det relativa bidraget från osteoblaster och osteoklaster till en given beneffekt. Fjällen saknar osteocyter, som är vanliga i däggdjursben och är de viktigaste drivkrafterna för benmekanosensorisk respons; Skalreparation och regenerering i denna modell drivs främst av osteoblaster med efterföljande remodellering av osteoklaster 8,9. Det är viktigt att notera att variation förekommer mellan individer ochåldersgrupper 20 år. För att minimera detta måste fjällskördsområdet vara konstant, eftersom olika platser kan ge upphov till olika fjällmorfologier, och fisk från samma syskongrupper används så att ålder och storlek är konsekventa. Men eftersom flera fjäll kan skördas per fisk kan man köra fler experiment med färre fiskar, vilket minskar den inomindividuella variabiliteten.
Sammanfattningsvis visar dessa protokoll experimentella tekniker som kan tillämpas på ontogenetiska och regenererande skalor. Sammanfattningsvis visar elasmoidfjäll stor potential som en skelettmodell för att hjälpa till att förstå benbildning och reparation; och kommer att bidra till att minska djuranvändningen för screening av osteoanabola föreningar med hög kapacitet.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka Mathew Green från Animal Service Unit för fiskuppfödning och Katy Jepson från Wolfson Bioimaging Centre. CLH, DB och QT finansierades av Versus Arthritis (CLH Senior Fellowship 21937, DB and QT Intermediate Fellowship 22044), RR finansierades av (NHMRC APP1158758). Detta arbete stöddes också av BBSRC-bidraget (BB/T001984/1).
10x Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 70013-016 | PBS |
12-Multichanel Pipette | Sartorius | 728230 | Multichanel pipette, Proline Plus Mechanical Pipette, 12 Channel, , 10-100 µL. |
15 mL Centrifuge tubes | Corning | 430791 | Centrifuge tube, CentriStar Cap, Polypropylene, RNAse/DNAse free, Non-pyrogenic |
4% Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | PFA |
Alizarin red | Sigma | A5533 | |
Amphotericin B | ThermoFisher Scientific | 15290026 | |
Bemis Parafilm M Laboratory Wrapping Film | Fisher Scientific | 11772644 | Sealing film |
Calcein powder | Sigma | C0875 | |
Calcium Chloride | Thermo Scientific | L13191.30 | |
Corning 96 well plate | Corning | 3596 | 96-well-plate, Clear, Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates, Individually Wrapped, with Lid, Sterile |
Cover slips | VWR | 631-0146 | |
Cytiva HyClone Iron-Supplemented Calf Serum | Fisher Scientific | SH30072.03 | |
Danieau | Sigma | ||
DMEM | Life Technologies | 31053 | |
Falcon tubes | Corning | 430828 | |
Fast Red Violet LB stock solution | Sigma | F3381 | |
GlutaMAX Supplement | Life Technologies | 35050 | |
Glycerol | Sigma | 81381 | |
Hepes | Sigma | H3375 | |
Incubator | X | Incubator, Set up to 28 °C and 5% CO2 | |
IncuCyte Zoom | Sartorious | X | Live Imaging System, Set up to 28 °C and 5% CO2 |
Leica stereomicroscope | X | Sterioscope | |
L-tartrate dibasic dihydrate | Sigma | 228729 | |
Mgcl2 | BDH Laboratory Sup. | 261237T | |
Microscope slides | Epredia | J2800AMNZ | |
Mowiol 4-88 | Sigma | 9002-89-5 | |
MQ water | X | ||
N, N’-dimethylformamide (Merck: D4451) | Merck | D4451 | |
NaCL | Fisher Chemical | S/3120/53 | |
Naphthol AS-MX phosphate | Merck | N4875 | |
NBT/BCIP solution | Sigma | #000000011681451001 | |
Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140 | |
Petri Dishes | Corning | 430589 | 35 mm sterile Petri dish, Non-treated, Nonpyrogenic, Polystyrene. |
Reagent Reservoir | Startub | E2310-1025 | 25mL Reagent Reservoir |
Silver nitrate | Sigma | 209139 | |
Sodium acetate | Sigma | 52889 | |
Sodium beta-glycerophosphate pentahydrate | Thermo Scientific | L03425.14 | |
Sodium pyruvate solution | Sigma | S8636 | |
Sodium tartrate | Sigma | S4797 | |
Sodium thioculphate | Sigma | 563188 | |
Tricaine methane sulfonate (MS222) | Sigma | E10521 | |
Tris | Sigma | 252859 | |
Triton-X100 | Sigma | T8787 | |
Tween-20 | SLS | CHE3852 | |
Tweezers Number 5 | Dumont | 500341 | Tweezer, INOX, biology grade |
Zebrafish tanks | Tecniplast | ZB30BCP | 3.5 L – 28 cm x 11 cm x 17 cm |
Zebrafish tanks | Tecniplast | ZB30BCP | 1 L – 28 cm x 7 cm x 11 cm |