En in vitro-modell av benmargens vaskulære nisje etableres ved å så mesenkymale og endotelceller på prefabrikerte 3D PEG-hydrogeler. Endotelnettverkene, ECM-komponentene og ALP-aktiviteten til nisjene varierer avhengig av vekstfaktoren som brukes. Plattformen kan brukes til avanserte kreftmodeller.
Benet og benmargen er svært vaskulariserte og strukturelt komplekse organer, og er steder for kreft og metastasedannelse. In vitro-modeller som rekapitulerer bein- og benmargsspesifikke funksjoner, inkludert vaskularisering, som er kompatible med legemiddelscreening, er svært ønskelig. Slike modeller kan bygge bro over gapet mellom forenklede, strukturelt irrelevante todimensjonale (2D) in vitro-modeller og de dyrere, etisk utfordrende in vivo-modellene . Denne artikkelen beskriver en kontrollerbar tredimensjonal (3D) samkulturanalyse basert på konstruerte poly (etylenglykol) (PEG) matriser for generering av vaskulariserte, osteogene beinmargnisjer. PEG-matrisedesignet tillater utvikling av 3D-cellekulturer gjennom et enkelt cellesåingstrinn som ikke krever innkapsling, og muliggjør dermed utvikling av komplekse samkultursystemer. Videre er matrisene gjennomsiktige og prefabrikkerte på 96-brønns bildeplater med glassbunn, noe som gjør systemet egnet for mikroskopi. For analysen beskrevet her, dyrkes humane benmargsavledede mesenkymale stromale celler (hBM-MSC) først til et tilstrekkelig utviklet 3D-cellenettverk dannes. Deretter tilsettes GFP-uttrykkende humane navlestrengendotelceller (HUVEC). Kulturutviklingen følges av lysfelt- og fluorescensmikroskopi. Tilstedeværelsen av hBM-MSC-nettverket støtter dannelsen av vaskulære strukturer som ellers ikke ville dannes og som forblir stabile i minst 7 dager. Omfanget av vaskulær-lignende nettverksdannelse kan enkelt kvantifiseres. Denne modellen kan justeres mot en osteogen benmargsnisje ved å supplere kulturmediet med benmorfogenetisk protein 2 (BMP-2), som fremmer osteogen differensiering av hBM-MSC, vurdert ved økt alkalisk fosfatase (ALP) aktivitet på dag 4 og dag 7 av samkultur. Denne cellulære modellen kan brukes som en plattform for å dyrke ulike kreftceller og studere hvordan de samhandler med bein- og benmargsspesifikke vaskulære nisjer. Videre er det egnet for automatisering og analyser med høyt innhold, noe som betyr at det vil muliggjøre kreftmedisinscreening under svært reproduserbare kulturforhold.
Benet og benmargen er strukturelt og funksjonelt komplekse organer som er sentrale for menneskers helse. Dette gjenspeiles av eksistensen av forskjellige nisjer som regulerer hematopoiesis og beinvedlikehold1. Det er nå allment akseptert at i sunn benmarg styres vedlikehold og utvidelse av hematopoietiske og skjelettstamceller, så vel som deres avkom, av forskjellige nisjer. Disse nisjene omfatter forskjellige celletyper, inkludert osteolineære celler, mesenkymale stamceller, endotel- og perivaskulære celler, nevron- og gliaceller, adipocytter, osteoklaster, makrofager og nøytrofiler2. Ikke overraskende er disse for det meste vaskulaturassosierte nisjer også involvert i utviklingen av ulike typer leukemi3 og er stedet for metastase for forskjellige kreftformer4. På grunn av sine spesifikke roller i beindannelse, remodellering og vedlikehold av bein (marg), har den beinassosierte vaskulaturen distinkte spesialiserte strukturer som er forskjellige fra vaskulaturen som finnes andre steder i kroppen 5,6,7. Dermed kan anti-angiogene eller vaskulaturmodulerende legemidler anvendt systemisk ha forskjellige effekter innenfor disse spesialiserte miljøene8. Derfor er modeller for å undersøke molekylære mekanismer involvert i å opprettholde ben- og benmargens fysiologiske egenskaper, ben- og benmargregenerering og respons på terapeutiske behandlinger svært ønskelig.
Klassiske todimensjonale (2D) vevskulturer og in vivo undersøkelser ved hjelp av dyremodeller har gitt uvurderlig innsikt i rollene til forskjellige celler og molekylære aktører involvert i utviklingen av bein og benmarg 9,10. Modeller som tillater eksperimenter med høy gjennomstrømning med relevante humane celler, kan forbedre vår forståelse av hvordan man modulerer utvalgte parametere i disse svært komplekse systemene.
I det siste tiåret har prinsipper avledet fra vevsteknikk blitt brukt til å generere 3D-vevsmodeller11,12. Disse har for det meste basert seg på innkapsling av vevsrelevante celler i biomaterialer for å etablere 3D-mono- eller kokulturer13. Blant de mest brukte biomaterialene er fibrin 14, kollagen 15 og Matrigel16,17, som alle er svært biokompatible og gir passende forhold for vekst av mange celletyper. Disse biomaterialene har evnen til å generere in vitro-modeller som rekapitulerer viktige aspekter ved de forskjellige vaskulære nisjene som finnes in vivo18. Videre har bruken av mikrofluidiske enheter for å generere perfuserte vaskulære ben- og benmargsmodeller bidratt til generering av in vitro-modeller med høyere kompleksitet 19,20,21,22.
Vanskeligheten med å kontrollere sammensetningen og konstruere egenskapene til naturlig forekommende biomaterialer har inspirert utviklingen av syntetiske analoger som kan utformes rasjonelt med forutsigbare fysiske, kjemiske og biologiske egenskaper23,24. Vi har utviklet helsyntetiske faktor XIII (FXIII) tverrbundne poly (etylenglykol) (PEG) -baserte hydrogeler, som er funksjonalisert med RGD-peptider og matriksmetalloprotease (MMP) spaltningssteder for å lette cellefeste og ombygging25,26. Den modulære utformingen av disse biomaterialene har blitt brukt til å optimalisere forholdene for dannelsen av 3D-vaskulariserte bein- og benmargsmodeller27,28.
For testing av et større antall forskjellige kulturbetingelser og nye terapier, er det nødvendig med modeller med høyere gjennomstrømningsevne. Vi har nylig vist at FXIII kryssbinding av vår PEG-hydrogel kan styres gjennom en elektrokjemisk prosess slik at en dyptgående hydrogelstivhetsgradient dannes29. Når celler legges på toppen av slike hydrogeler, migrerer de mot det indre og utvikler seg gradvis til svært sammenkoblede3D-mobilnettverk 30. Eliminering av behovet for å innkapsle celler i hydrogelen, som vanligvis er tilstede med andre 3D-stillas, forenkler ikke bare eksperimentell design, men tillater også sekvensiell tilsetning av forskjellige celletyper på forskjellige tidspunkter for å generere komplekse samkultursystemer. Disse hydrogelene er tilgjengelige forhåndsstøpt på 96-brønns bildeplater med glassbunn, noe som gjør etableringen av 3D-kulturer oppnåelige ved manuelle så vel som automatiserte cellesåprotokoller. Den optiske gjennomsiktigheten til PEG-hydrogelene gjør plattformen kompatibel med mikroskopi.
Her presenterer vi en enkel metode for generering og karakterisering av vaskulariserte osteogene nisjer innenfor denne bruksklare, syntetiske plug-and-play-plattformen. Vi viser at utviklingen av vaskulære nettverk kan stimuleres med en vekstfaktor som vanligvis brukes til å indusere in vitro osteogenese, benmorfogenetisk protein-2 (BMP-2), mens osteogen differensiering kan forebygges ved tilskudd av fibroblastvekstfaktor 2 (FGF-2)27,31. De dannede nettverkene er forskjellige sammenlignet med FGF-2-stimulerte nettverk når det gjelder det generelle utseendet, samt celle- og ECM-fordelingen. Videre overvåket vi osteogen induksjon med alkalisk fosfatase som markør. Vi demonstrerer det økte uttrykket av denne markøren over tid og sammenligner uttrykket med det i FGF-2-stimulerte nettverk ved hjelp av kvalitative og kvantitative metoder. Til slutt demonstrerer vi egnetheten til de genererte nisjene i denne modellen for to potensielle applikasjoner. For det første utførte vi en proof-of-concept legemiddelsensitivitetsanalyse ved å legge bevacizumab til forhåndsformede nisjer og overvåke nedbrytningen av de vaskulære nettverkene i dens nærvær. For det andre la vi MDA-MB-231 brystkreft og U2OS osteosarkomceller til forhåndsformede osteogene nisjer, noe som viser at nisjene kan brukes til å studere interaksjoner mellom kreftceller og deres miljø.
Her beskriver vi en protokoll for etablering av en in vitro-modell av svært vaskulariserte bein- og benmargnisjer i en helsyntetisk og kontrollerbar 3D PEG-basert matrise, som har en rekke anvendelser innen bein- og benmargsbiologisk forskning, vevsteknikk og kreftforskning. Denne modellen bygger på en syntetisk PEG-basert hydrogel som er funksjonalisert med RGD-peptider og MMP-spaltningssteder og er støpt med en dyptgående tetthetsgradient på glassbunn 96-brønns bildeplater30. Denne plug-and-play-plattformen ble vist å tillate etablering av svært sammenkoblede 3D-mobilnettverk uten behov for å innkapsle celler i hydrogelen. I likhet med den tidligere beskrevne celleinnkapslingsprotokollen, viser vi i dette arbeidet ombyggingen av substratet med et celleiboende ECM28 for å skape et celletypespesifikt mikromiljø. Med denne metoden kan derfor medikamentscreeningsanalyser og høyinnholdsanalyser enkelt utføres under svært reproduserbare, organotypiske 3D-kulturforhold. Glassbunnplatene med 96 brønner og de optisk transparente hydrogelene gjør plattformen kompatibel med automatisering av væskehåndtering og mikroskopi med høy gjennomstrømning.
Det første trinnet i å generere en osteogen vaskulær benmargnisje er prekulturen av hBM-MSC på PEG-hydrogelen i minst 3 dager. I løpet av denne tiden fester de seg til hydrogelen, trenger inn i den og begynner å etablere cellekontakter og ECM-avsetning. Før såing av hBM-MSC-ene, må lagringsbufferen fjernes. Siden hydrogelen ligger inne i en indre brønn innenfor standardbrønnen til 96-brønns bildeplaten, er det trygt å sette inn aspirasjonsspissen langs siden av brønnen til den berører den indre brønnringen. En vakuumpumpe kan brukes til aspirasjon hvis den er satt på lavest mulig sugekraft. Alternativt kan en automatisert platevasker med dysehøyden justert til minst 0,8 mm over den indre brønnringen brukes til å aspirere bufferen fra hydrogelplaten. Bruk av automatisering for væskehåndtering kan minimere skade på hydrogeloverflaten og føre til høyere reproduserbarhet av de resulterende kulturer. Små defekter på hydrogeloverflaten blir synlige når cellene legger seg på hydrogelen og vises på et lavere fokusplan i defekte hydrogelområder. Derfor tjener innhenting av referansebilder på dag 0 som en god kvalitetskontroll for cellesåingshomogeniteten og hydrogeloverflatens integritet. Mens små hydrogeloverflatedefekter ikke utelukker videre bruk av brønnen, har cellene en tendens til å klynge seg på de defekte områdene og kan vokse til ikke-representative mønstre eller raskere nå bunnglasset, hvor de vokser til et monolag. Disse artefaktene må noteres ved bruk/evaluering av disse brønnene. Lignende hensyn gjelder for eventuelle middels endringer som utføres i løpet av hele analysens varighet.
Det andre trinnet i protokollen innebærer tilsetning av GFP-HUVECs til den forhåndsformede hBM-MSC monokulturen (dag 0 av samkultur). ECM avsatt av hBM-MSC gir et flott stillas for vekst av endotelceller, som i dette arbeidet, selv i nærvær av hBM-MSC-betinget medium, bare kunne danne runde celleklynger på hydrogelene (ikke vist). Ved såing på hBM-MSC-kulturene integrerer og danner HUVECene mikrofartøylignende strukturer som er sammenlignbare med de som observeres i kokulturer generert ved celleinnkapsling27,28. Vanligvis dannes velutviklede 3D-mikrovaskulære nettverk innen 4 dager etter samkultur, og dette kan overvåkes i lengderetningen ved bruk av GFP-merkede HUVEC. Disse strukturene kan opprettholdes i minst 7 dager i kultur, noe som betyr at det er tilstrekkelig tid til å følge endringer i den vaskulære nettverksorganisasjonen som respons på behandlinger, for eksempel for screening av anti-angiogene legemidler. De morfologiske elementene i endotelnettverket kan kvantifiseres i batchmodus ved å segmentere GFP-bildene ved hjelp av veletablerte verktøy, for eksempel Angiogenesis Analyzer-plugin for ImageJ33, og deres parametere kan brukes til å evaluere for eksempel legemiddeleffektivitet og farmakodynamikk.
En betydelig fordel ved den beskrevne cellulære modellen for mange potensielle applikasjoner er dens plastisitet. Bare å supplere kulturmediet med forskjellige vekstfaktorer kan endre utseendet til samkulturen. For eksempel skaper tilstedeværelsen av BMP-2 gjennom mono- og samkulturperioden en osteogen vaskulær nisje, som viser økt ALP-aktivitet, ekstracellulær kalsiumavsetning, samt ECM-montering og avsetning. Tvert imot, i nærvær av FGF-2, er de osteogene markørene fraværende, og samkulturen danner færre laterale celleforeninger, men viser mer uttalt 3D-cellevekst. At FGF-2 demper ALP-aktivitet mens BMP-2 utløser sterkere ALP-aktivitet sammenlignet med ingen vekstfaktorbehandling, er i samsvar med tidligere observasjoner27. Likevel, til tross for disse store forskjellene i hBM-MSC stromalkomponenten, var omfanget av det mikrovaskulære nettverket svært likt for de to vekstfaktorbehandlede forholdene i dette arbeidet. I kontrollkulturene dannet det seg bare noen få korte vaskulære nettverk, noe som kanskje representerte en dårlig vaskularisert benmargsnisje. Dette antyder at ved ganske enkelt å endre type, konsentrasjon og timing av vekstfaktorene som legges til kulturmediet, kan en rekke veldefinerte vaskulariserte benmargnisjer, som ville være nødvendig for komparative studier, bli produsert. For å sikre reproduserbare resultater er det imidlertid viktig å merke seg at kulturprogresjonen og morfologien kan variere avhengig av historien til cellene som brukes (f.eks. passasjenummer og løsrivelsesmetode som brukes under rutinemessig kulturvedlikehold), og det anbefales å kontrollere for slike faktorer under analysedesignet.
Her, som en første anvendelse av denne modellen, demonstrerer vi sensitiviteten til de konstruerte mikrovaskulære nettverkene til behandling med 10 μg / ml bevacizumab. Spesielt er det viktig å bekrefte at algoritmen som brukes, nøyaktig kan gjenkjenne endotelnettverket, da artefakter ofte genereres i bilder med dårlig utviklede nettverk. Hvis dette er tilfelle, må parametrene som brukes til bildebehandling (før og under segmentering) finjusteres, ofte på prøve-og-feile-basis.
Som en annen applikasjon presenterer vi en avansert samkulturmodell dannet av sekvensiell såing av mesenkymale, endotel- og kreftceller. Denne modellen gjør det mulig å studere interaksjonene mellom kreftceller, stroma og benmargens vaskulatur, noe som kan være viktige faktorer under metastase. I tillegg kan denne modellen brukes til narkotikascreeningsapplikasjoner og testing av forbindelser med mål utover angiogenese.
I 2D-kulturer mottar ikke celler fysiologiske mikromiljøsignaler, får ikke naturlig forekommende cellemorfologier, og skiller seg følgelig annerledes sammenlignet med celler i innfødte 3D-miljøer35. Når de vokser i konstruerte 3D-hydrogeler, deponerer cellene tidlig en iboende ECM, som gir vedheftsteder og kan aktivt omformes 28,36. Her, for å etablere en forenklet 3D-modell for screeningapplikasjoner, ble fartøydannende celler sådd på overflaten av konstruerte hydrogeler og tillatt å etablere vaskulære nettverk i fravær av perfusjon. De bildebaserte evalueringene ble utført på 2D-projeksjoner av endotelceller som bidrar til vaskulære strukturer. Imidlertid viste bare konfokale bilder den mindre uttalte innveksten av 3D-vaskulære nettverk i BMP-2-stimulerte prøver sammenlignet med FGF-2-stimulerte prøver. Dette antyder at lengden på de dannede vaskulære strukturer ble undervurdert, mens deres tilkobling ble overvurdert. I tillegg er interaksjoner mellom perivaskulære og endotelceller og vaskulær lumendannelse ikke undersøkt. Disse aspektene, særlig når det gjelder tiltak mot narkotikabehandling, vil kreve ytterligere oppmerksomhet. Til slutt vil raffinerte protokoller for først å etablere omfattende 3D-vaskulære nettverk og først deretter indusere deres osteogene differensiering være ønskelig for å generere flere fysiologiske ben- og benmargsmodeller.
Samlet sett er modellen som presenteres her svært allsidig og kan enkelt skreddersys mot spesifikke applikasjoner. For eksempel kan mesenkymale og endotelceller fra forskjellige kilder brukes. Det er kjent at fettvev MSC og navlestrengs-MSC uttrykker forskjellige angiogene faktorer sammenlignet med BM-MSC, og de kan lett erstattes som en alternativ stromalkomponent37. Endotelceller isolert fra allerede definerte benmargsnisjer kan også brukes i stedet for HUVEC. Man kan også etablere samkulturen med pasientavledede, matchende benmargsmesenkymale og endotelceller for persontilpassede medisinapplikasjoner, som nylig har blitt foreslått for vaskulariserte muskelkulturer38. I tillegg tillater utformingen av hydrogelplaten langsgående overvåking av kulturen med både lysfelt og fluorescensmikroskopi, og gir dermed brukeren muligheten til å forkorte eller forlenge kulturtiden avhengig av applikasjonen. Alternativt kan celletettheten som brukes til såing justeres tilsvarende for å akselerere eller forsinke dannelsen av cellenettverket dersom det er behov for kortere eller lengre observasjonstider enn de i denne protokollen. I alle fall er det nødvendig med forsiktighet for å unngå celleovervekst i arklignende strukturer, noe som kan føre til sammentrekning av hydrogelen og eventuell celleavløsning.
Til slutt kan et bredt spekter av analyser utføres ved hjelp av denne modellen. I tillegg til immunfluorescens og mikroskopi utført i levende eller faste kulturer, kan 3D-kulturene fordøyes enzymatisk, og cellene kan hentes og underkastes enhver form for biokjemisk analyse. Her demonstrerer vi bestemmelsen av ALP-aktivitet og DNA-innholdskvantifisering i cellelysater ved hjelp av kolorimetriske / fluorometriske analyser, men systemet er kompatibelt med mange andre teknikker, inkludert PCR, RNAseq og proteomikk. Hvis sensitiviteten til den ønskede analysen ikke er veldig høy, kan man samle prøver fra mer enn en brønn for å øke mengden prøve som er tilgjengelig for analysen. Hvis den ønskede applikasjonen krever raskere geloppløsning, kan orbital risting av platen påføres i kombinasjon med mindre volumer av fordøyelsesløsningen for å sikre vortexdannelse i brønnene, forutsatt at alle brønner på platen vil bli brukt på denne måten (levende kulturer er følsomme for slik hard håndtering). Oppsummert presenterer vi her en protokoll som, hvis den brukes som beskrevet, garanterer generering av en in vitro-modell som rekapitulerer de viktigste aspektene ved osteogene vaskulære nisjer, men er også allsidig nok til å bli modifisert for skreddersydde applikasjoner.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gjerne takke Riccardo Urbanet for teknisk assistanse med væskehåndteringsanordningene og Rodi Odabasi for støtte med epifluorescensmikroskopien. Dette arbeidet ble finansiert av Swiss National Science Foundation (tilskuddsnummer 310030E_202429 og 205321_204318) og Ectica Technologies AG.
0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-072 | |
2 mL microtubes | Eppendorf | 30120094 | |
2-Amino-2-methyl-1-propanol | Sigma | A9199 | |
3DProSeed hydrogel well plate | Ectica Technologies | ECT.PS1.001.096 | |
4-Nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate | Sigma | 71768 | |
Alizarin Red S | Sigma | A5533 | |
Anti-Collagen IV antibody | Abcam | ab6311 | |
Anti-Laminin 1+2 antibody | Abcam | ab7463 | |
Automated plate washer | Agilent Biotek | ELχ50 | |
Automated washer/dispenser | Agilent Biotek | MULTIFLO FX equipped with a peristaltic pump 5uL cassette | |
Bevacizumab | Evidentic | ID PS-E07-2019-00119 A009 | |
BMP-2 | Peprotech | 120-02C | |
BSA | AppliChem | A1391 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5415 R | To centrifuge 2 mL tubes at 16100 x g during ALP analysis |
Confocal laser scanning microscope | Leica | Stellaris 5 | |
Conical 50 mL centrifuge tubes | TPP | 91050 | |
DAPI | Sigma | D9542 | |
DyLight 649 Donkey anti-rabbit IgG (minimal x-reactivity) Antibody | Biolegend | 406406 | |
DyLight 649 Goat anti-mouse IgG (minimal x-reactivity) Antibody | Biolegend | 405312 | |
EGM-2 | Lonza | CC-3162 | |
Epifluorescence microscope | Leica | DMI6000B | |
FBS | Gibco | 10500-064 | |
FGF-2 | Peprotech | 100-18B | |
Fibronectin (IST-9) | Santa Cruz | sc-59826 | |
GFP-HUVECs | PELOBiotech | PB-CAP-0001GFP | |
hBM-MSCs | – | – | Isolated at University Hospital Basel; Papadimitropoulos A, Piccinini E, Brachat S, et al. Expansion of human mesenchymal stromal cells from fresh bone marrow in a 3D scaffold-based system under direct perfusion. PLoS One. 2014;9(7):e102359 |
Inverted microscope | Zeiss | 200M | |
Magnesium chloride | Sigma | M8266 | |
MDA-MB-231 breast cancer cell line | – | Kindly obtained from J Massagué at the Memorial Sloan-Kettering Cancer Center | |
MEMα | Gibco | 22571-038 | |
Multimode imaging reader | Agilent Biotek | Cytation 1 | For automated imaging |
Multimode imaging reader – fluorescence and absorbance | Agilent Biotek | Cytation 5 | For measuring absorbance and fluorescence intensity duing ALP analysis |
Paraformaldehyde | Artechemis | US 040 | |
PBS | Gibco | 10010-015 | |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
Phalloidin-rhodamine | Invitrogen | R415 | |
Picro-Sirius Red Solution | Abcam | ab246832 | |
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit | ThermoFisher Scientific | P7589 | |
Recombinant Anti-Collagen I antibody | Abcam | ab260043 | |
SIGMAFAST BCIP/NBT | Sigma | B5655-25TAB | |
Sodium hydroxide | Sigma | 1064981000 | |
Sodium phosphate dibasic, anhydrous | Sigma | S-0876 | |
Sodium phosphate monobasic, monohydrate | Merck | 1.06346 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
Tween20 | AppliChem | A4974 | |
U2OS osteosarcoma cell line | – | Kindly obtained from J Snedeker at the Institute for Biomechanics, Zurich | |
α-trehalose dihydrate | Sigma | 90208 |