En in vitro-modell av benmärgens vaskulära nisch etableras genom sådd av mesenkymala och endotelceller på prefabricerade 3D PEG-hydrogeler. Endotelnätverken, ECM-komponenterna och ALP-aktiviteten hos nischerna varierar beroende på vilken tillväxtfaktor som används. Plattformen kan användas för avancerade cancermodeller.
Benet och benmärgen är mycket vaskulariserade och strukturellt komplexa organ och är platser för cancer- och metastasbildning. In vitro-modeller som rekapitulerar ben- och benmärgsspecifika funktioner, inklusive vaskularisering, som är kompatibla med läkemedelsscreening är mycket önskvärda. Sådana modeller kan överbrygga klyftan mellan förenklade, strukturellt irrelevanta tvådimensionella (2D) in vitro-modeller och de dyrare, etiskt utmanande in vivo-modellerna . Denna artikel beskriver en kontrollerbar tredimensionell (3D) samodlingsanalys baserad på konstruerade poly (etylenglykol) (PEG) matriser för generering av vaskulariserade, osteogena benmärgsnischer. PEG-matrisdesignen möjliggör utveckling av 3D-cellkulturer genom ett enkelt cellsåddsteg som inte kräver någon inkapsling, vilket möjliggör utveckling av komplexa samodlingssystem. Dessutom är matriserna transparenta och prefabricerade på 96-brunnsplattor med glasbotten, vilket gör systemet lämpligt för mikroskopi. För den analys som beskrivs här odlas humana benmärgshärledda mesenkymala stromaceller (hBM-MSC) först tills ett tillräckligt utvecklat 3D-cellnätverk bildas. Därefter tillsätts GFP-uttryckande humana navelvenendotelceller (HUVEC). Kulturutvecklingen följs av ljusfälts- och fluorescensmikroskopi. Närvaron av hBM-MSC-nätverket stöder bildandet av vaskulära strukturer som annars inte skulle bildas och som förblir stabila i minst 7 dagar. Omfattningen av vaskulärliknande nätverksbildning kan lätt kvantifieras. Denna modell kan ställas in mot en osteogen benmärgsnisch genom att komplettera odlingsmediet med benmorfogenetiskt protein 2 (BMP-2), vilket främjar den osteogena differentieringen av hBM-MSC, bedömd genom ökad alkalisk fosfatas (ALP) aktivitet vid dag 4 och dag 7 av samkulturen. Denna cellulära modell kan användas som en plattform för att odla olika cancerceller och studera hur de interagerar med ben- och benmärgsspecifika vaskulära nischer. Dessutom är det lämpligt för automatisering och analyser med högt innehåll, vilket innebär att det skulle möjliggöra screening av cancerläkemedel under mycket reproducerbara odlingsförhållanden.
Benet och benmärgen är strukturellt och funktionellt komplexa organ som är centrala för människors hälsa. Detta återspeglas av förekomsten av distinkta nischer som reglerar hematopoies och benunderhåll1. Det är nu allmänt accepterat att i frisk benmärg styrs underhåll och expansion av hematopoetiska och skelettstamceller, liksom deras avkomma, av distinkta nischer. Dessa nischer omfattar olika celltyper, inklusive osteolineageceller, mesenkymala stamceller, endotel- och perivaskulära celler, neuronala och gliaceller, adipocyter, osteoklaster, makrofager och neutrofiler2. Inte överraskande är dessa mestadels vaskulaturassocierade nischer också involverade i utvecklingen av olika typer av leukemi3 och är platsen för metastaser för olika cancerformer4. På grund av dess specifika roller i benbildning, ombyggnad och ben (märg) underhåll, har den benassocierade vaskulaturen distinkta specialiserade strukturer som skiljer sig från den vaskulatur som finns någon annanstans i kroppen 5,6,7. Således kan antiangiogena eller vaskulaturmodulerande läkemedel som appliceras systemiskt ha olika effekter inom dessa specialiserade miljöer8. Därför är modeller för att undersöka de molekylära mekanismerna som är involverade i att upprätthålla ben- och benmärgsfysiologiska egenskaper, ben- och benmärgsregenerering och svar på terapeutiska behandlingar mycket önskvärda.
Klassiska tvådimensionella (2D) vävnadskulturer och in vivo-undersökningar med djurmodeller har gett ovärderlig insikt i rollerna hos olika celler och molekylära aktörer som är involverade i utvecklingen av ben och benmärg 9,10. Modeller som möjliggör experiment med hög genomströmning med relevanta mänskliga celler kan förbättra vår förståelse för hur man modulerar utvalda parametrar i dessa mycket komplexa system.
Under det senaste decenniet har principer som härrör från vävnadsteknik använts för att generera 3D-vävnadsmodeller11,12. Dessa har främst förlitat sig på inkapsling av vävnadsrelevanta celler i biomaterial för att etablera 3D-mono- eller samkulturer13. Bland de mest använda biomaterialen är fibrin 14, kollagen15 och Matrigel16,17, som alla är mycket biokompatibla och ger lämpliga förutsättningar för tillväxt av många celltyper. Dessa biomaterial har förmågan att generera in vitro-modeller som rekapitulerar viktiga aspekter av de olika vaskulära nischerna som finns in vivo18. Dessutom har användningen av mikrofluidiska anordningar för att generera perfuserade vaskulära ben- och benmärgsmodeller bidragit till genereringen av in vitro-modeller med högre komplexitet 19,20,21,22.
Svårigheten att kontrollera sammansättningen och konstruera egenskaperna hos naturligt förekommande biomaterial har inspirerat utvecklingen av syntetiska analoger som kan utformas rationellt med förutsägbara fysiska, kemiska och biologiska egenskaper23,24. Vi har utvecklat helsyntetiska faktor XIII (FXIII) tvärbundna poly(etylenglykol) (PEG)-baserade hydrogeler, som är funktionaliserade med RGD-peptider och matrismetalloprotease (MMP) klyvningsställen för att underlätta cellbindning och ombyggnad25,26. Den modulära designen av dessa biomaterial har framgångsrikt använts för att optimera förhållandena för bildandet av 3D-vaskulariserade ben- och benmärgsmodeller27,28.
För testning av ett större antal olika odlingsförhållanden och nya terapier krävs modeller med högre genomströmningskapacitet. Vi har nyligen visat att FXIII-tvärbindningen av vår PEG-hydrogel kan styras genom en elektrokemisk process så att en djupgående hydrogelstyvhetsgradient bildas29. När celler läggs ovanpå sådana hydrogeler migrerar de mot det inre och utvecklas gradvis till mycket sammankopplade 3D-cellulära nätverk30. Elimineringen av behovet av att kapsla in celler i hydrogelen, som vanligtvis finns med andra 3D-byggnadsställningar, förenklar inte bara den experimentella designen utan möjliggör också sekventiell tillsats av olika celltyper vid olika tidpunkter för att generera komplexa samodlingssystem. Dessa hydrogeler är tillgängliga prefabricerade på glasbottnade 96-brunnsavbildningsplattor, vilket gör upprättandet av 3D-kulturer uppnåeligt genom manuella såväl som automatiserade cellsåddprotokoll. Den optiska transparensen hos PEG-hydrogelerna gör plattformen kompatibel med mikroskopi.
Här presenterar vi en enkel metod för generering och karakterisering av vaskulariserade osteogena nischer inom denna färdiga, syntetiska plug-and-play-plattform. Vi visar att utvecklingen av vaskulära nätverk kan stimuleras med en tillväxtfaktor som vanligen används för att inducera in vitro osteogenes, benmorfogenetiskt protein-2 (BMP-2), medan osteogen differentiering kan förhindras genom tillskott av fibroblasttillväxtfaktor 2 (FGF-2)27,31. De nätverk som bildas är olika jämfört med FGF-2-stimulerade nätverk när det gäller det övergripande utseendet, liksom cell- och ECM-fördelningen. Dessutom övervakade vi den osteogena induktionen med alkaliskt fosfatas som markör. Vi demonstrerar det ökade uttrycket av denna markör över tid och jämför uttrycket med det i FGF-2-stimulerade nätverk med kvalitativa och kvantitativa metoder. Slutligen demonstrerar vi lämpligheten hos de genererade nischerna i denna modell för två potentiella applikationer. För det första utförde vi en proof-of-concept läkemedelskänslighetsanalys genom att tillsätta bevacizumab till förformade nischer och övervaka nedbrytningen av de vaskulära nätverken i dess närvaro. För det andra lade vi till MDA-MB-231 bröstcancer och U2OS osteosarkomceller till förformade osteogena nischer, vilket visar att nischerna kan användas för att studera interaktioner mellan cancerceller och deras miljö.
Här beskriver vi ett protokoll för etablering av en in vitro-modell av högvaskulariserade ben- och benmärgsnischer i en helt syntetisk och kontrollerbar 3D PEG-baserad matris, som har en mängd olika tillämpningar inom ben- och benmärgsbiologiforskning, vävnadsteknik och cancerforskning. Denna modell bygger på en syntetisk PEG-baserad hydrogel som är funktionaliserad med RGD-peptider och MMP-klyvningsställen och gjuts med en djupgående densitetsgradient på glasbottnade 96-brunnsavbildningsplattor30. Denna plug-and-play-plattform visade sig möjliggöra etablering av mycket sammankopplade 3D-mobilnät utan att behöva kapsla in celler i hydrogelen. I likhet med det tidigare beskrivna cellinkapslingsprotokollet visar vi i detta arbete ombyggnad av substratet med en cellinneboende ECM28 för att skapa en celltypspecifik mikromiljö. Med denna metod kan således läkemedelsscreeninganalyser och analyser med högt innehåll enkelt utföras under mycket reproducerbara, organotypiska 3D-odlingsförhållanden. De glasbottnade 96-brunnsplattorna och de optiskt transparenta hydrogelerna gör plattformen kompatibel med automatisering av vätskehantering och mikroskopi med hög genomströmning.
Det första steget i att generera en osteogen vaskulär benmärgsnisch är förkulturen av hBM-MSC på PEG-hydrogelen i minst 3 dagar. Under denna tid fäster de vid hydrogelen, tränger in i den och börjar etablera cell-cellkontakter och ECM-avsättning. Innan hBM-MSC seedas måste lagringsbufferten tas bort. Eftersom hydrogelen är belägen inuti en inre brunn i standardbrunnen på 96-brunnsavbildningsplattan är det säkert att sätta in aspirationsspetsen längs brunnens sida tills den vidrör den inre brunnsringen. En vakuumpump kan användas för aspiration om den är inställd på lägsta möjliga sugkraft. Alternativt kan en automatiserad plattbricka med munstyckshöjden justerad till minst 0,8 mm ovanför den inre brunnsringen användas för att aspirera bufferten från hydrogelplattan. Användning av automatisering för vätskehantering kan minimera skador på hydrogelytan och leda till högre reproducerbarhet av de resulterande kulturerna. Små defekter på hydrogelytan blir synliga när cellerna sätter sig på hydrogelen och visas på ett lägre fokusplan i defekta hydrogelområden. Därför fungerar förvärv av referensbilder på dag 0 som en god kvalitetskontroll för cellsåddhomogeniteten och hydrogelytans integritet. Medan små hydrogelytdefekter inte utesluter vidare användning av brunnen, tenderar cellerna att kluster på de defekta områdena och kan växa till icke-representativa mönster eller snabbare nå bottenglaset, där de växer till ett monolager. Dessa artefakter måste noteras vid användning/utvärdering av dessa brunnar. Liknande överväganden gäller för alla medieförändringar som utförs under hela testets varaktighet.
Det andra steget i protokollet innebär tillägg av GFP-HUVECs till den förformade hBM-MSC-monokulturen (dag 0 av samkulturen). ECM deponerad av hBM-MSC ger en stor ställning för tillväxt av endotelceller, som i detta arbete, även i närvaro av hBM-MSC-konditionerat medium, endast kunde bilda runda cellkluster på hydrogelerna (visas inte). Vid sådd på hBM-MSC-kulturerna integreras HUVECs och bildar mikrokärlliknande strukturer jämförbara med de som observerats i samkulturer genererade genom cellinkapsling27,28. Vanligtvis bildas välutvecklade 3D-mikrovaskulära nätverk inom 4 dagar efter samkultur, och detta kan övervakas longitudinellt med hjälp av GFP-märkta HUVEC. Dessa strukturer kan bibehållas i minst 7 dagar i odling, vilket innebär att det finns tillräckligt med tid att följa förändringar i den vaskulära nätverksorganisationen som svar på behandlingar, såsom för screening av antiangiogena läkemedel. De morfologiska elementen i endotelnätverket kan kvantifieras i batchläge genom att segmentera GFP-bilderna med hjälp av väletablerade verktyg, såsom Angiogenesis Analyzer-plugin i ImageJ33, och deras parametrar kan användas för att utvärdera till exempel läkemedelseffektivitet och farmakodynamik.
En betydande fördel med den beskrivna cellulära modellen för många potentiella applikationer är dess plasticitet. Att helt enkelt komplettera odlingsmediet med olika tillväxtfaktorer kan förändra samkulturens utseende. Exempelvis skapar närvaron av BMP-2 under hela mono- och samodlingsperioden en osteogen vaskulär nisch, som visar ökad ALP-aktivitet, extracellulär kalciumavsättning samt ECM-montering och avsättning. Tvärtom, i närvaro av FGF-2 är de osteogena markörerna frånvarande, och samkulturen bildar färre laterala cellföreningar men visar mer uttalad 3D-celltillväxt. Det faktum att FGF-2 undertrycker ALP-aktivitet medan BMP-2 framkallar starkare ALP-aktivitet jämfört med ingen tillväxtfaktorbehandling är i enlighet med tidigare observationer27. Trots dessa stora skillnader i hBM-MSC-stromakomponenten var omfattningen av det mikrovaskulära nätverket mycket likartat för de två tillväxtfaktorbehandlade tillstånden i detta arbete. I kontrollkulturerna bildades endast några korta vaskulära nätverk, som kanske representerar en dåligt vaskulariserad benmärgsnisch. Detta tyder på att genom att helt enkelt ändra typen, koncentrationen och tidpunkten för tillväxtfaktorerna som läggs till odlingsmediet, kan en rad väldefinierade vaskulariserade benmärgsnischer, som skulle krävas för jämförande studier, produceras. För att säkerställa reproducerbara resultat är det dock viktigt att notera att odlingsprogressionen och morfologin kan variera beroende på de använda cellernas historia (t.ex. passagenummer och avskiljningsmetod som används vid rutinmässigt kulturunderhåll), och det är tillrådligt att kontrollera för sådana faktorer under analysdesignen.
Här, som en första tillämpning av denna modell, demonstrerar vi känsligheten hos de konstruerade mikrovaskulära nätverken för behandling med 10 μg / ml bevacizumab. Det är särskilt viktigt att bekräfta att algoritmen som används exakt kan känna igen endotelnätverket, eftersom artefakter ofta genereras i bilder med dåligt utvecklade nätverk. Om så är fallet måste parametrarna som används för bildbehandling (före och under segmentering) finjusteras, ofta på försök och fel.
Som en andra tillämpning presenterar vi en avancerad samkulturmodell bildad av sekventiell sådd av mesenkymala, endotelala och cancerceller. Denna modell gör det möjligt att studera interaktionerna mellan cancerceller, stroma och benmärgens vaskulatur, vilket kan vara viktiga faktorer under metastaser. Dessutom kan denna modell användas för läkemedelsscreeningapplikationer och testföreningar med mål bortom angiogenes.
I 2D-kulturer får celler inte fysiologiska mikromiljösignaler, förvärvar inte naturligt förekommande cellmorfologier och differentierar följaktligen annorlunda jämfört med celler i ursprungliga 3D-miljöer35. När de odlas i konstruerade 3D-hydrogeler deponerar cellerna tidigt en inneboende ECM, vilket ger vidhäftningsställen och kan aktivt omformas28,36. Här, för att etablera en förenklad 3D-modell för screeningapplikationer, såddes kärlbildande celler på ytan av konstruerade hydrogeler och fick etablera vaskulära nätverk i frånvaro av perfusion. De avbildningsbaserade utvärderingarna utfördes på 2D-projektioner av endotelcellerna som bidrar till vaskulära strukturer. Endast konfokala bilder avslöjade emellertid den mindre uttalade inväxten av 3D-vaskulära nätverk i BMP-2-stimulerade prover jämfört med FGF-2-stimulerade prover. Detta tyder på att längden på de bildade vaskulära strukturerna underskattades, medan deras anslutning överskattades. Dessutom har interaktioner mellan perivaskulära celler och endotelceller och vaskulär lumenbildning inte undersökts. Dessa aspekter, särskilt när det gäller svar på missbruksbehandling, kommer att kräva ytterligare uppmärksamhet. Slutligen skulle förfinade protokoll för att först etablera omfattande 3D-vaskulära nätverk och först därefter inducera deras osteogena differentiering vara önskvärda för att generera mer fysiologiska ben- och benmärgsmodeller.
Sammantaget är modellen som presenteras här mycket mångsidig och kan enkelt skräddarsys för specifika applikationer. Till exempel kan mesenkymala och endotelceller från olika källor användas. Det är känt att MSC för fettvävnad och MSC för navelsträng uttrycker olika angiogena faktorer jämfört med BM-MSC, och de kan lätt ersättas som en alternativ stromakomponent37. Endotelceller isolerade från redan definierade benmärgsnischer kan också användas istället för HUVEC. Man kan också etablera samkulturen med patienthärledda, matchande benmärgsmesenkymala och endotelceller för personliga medicinska tillämpningar, vilket nyligen har föreslagits för vaskulariserade muskelsamkulturer38. Dessutom möjliggör hydrogelplattans utformning longitudinell övervakning av kulturen med både ljusfälts- och fluorescensmikroskopi, vilket ger användaren möjlighet att förkorta eller förlänga odlingstiden beroende på applikationen. Alternativt kan celldensiteterna som används för sådd justeras i enlighet därmed för att påskynda eller fördröja bildandet av cellnätverket om kortare eller längre observationstider behövs än de i detta protokoll. I vilket fall som helst krävs försiktighet för att undvika cellöverväxt i arkliknande strukturer, vilket kan leda till sammandragning av hydrogelen och eventuell cellavskiljning.
Slutligen kan ett brett spektrum av analyser utföras med hjälp av denna modell. Förutom immunofluorescens och mikroskopi som utförs i levande eller fasta kulturer kan 3D-kulturerna enzymatiskt smältas och cellerna kan extraheras och utsättas för någon typ av biokemisk analys. Här demonstrerar vi bestämningen av ALP-aktivitet och DNA-innehållskvantifiering i celllysater med hjälp av kolorimetriska / fluorometriska analyser, men systemet är kompatibelt med många andra tekniker, inklusive PCR, RNAseq och proteomik. Om känsligheten hos den önskade analysen inte är särskilt hög kan man slå samman prover från mer än en brunn för att öka mängden prov som är tillgängligt för analysen. Om den önskade applikationen kräver snabbare gelupplösning kan orbital skakning av plattan appliceras i kombination med mindre volymer av matsmältningslösningen för att säkerställa virvelbildning i brunnarna, förutsatt att alla brunnar på plattan kommer att användas på detta sätt (levande kulturer är känsliga för sådan hård hantering). Sammanfattningsvis presenterar vi här ett protokoll som, om det används enligt beskrivningen, garanterar genereringen av en in vitro-modell som rekapitulerar de viktigaste aspekterna av osteogena vaskulära nischer men också är mångsidig nog att modifieras för skräddarsydda applikationer.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Riccardo Urbanet för teknisk hjälp med vätskehanteringsanordningarna och Rodi Odabasi för stöd med epifluorescensmikroskopin. Detta arbete finansierades av Swiss National Science Foundation (bidragsnummer 310030E_202429 och 205321_204318) och Ectica Technologies AG.
0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-072 | |
2 mL microtubes | Eppendorf | 30120094 | |
2-Amino-2-methyl-1-propanol | Sigma | A9199 | |
3DProSeed hydrogel well plate | Ectica Technologies | ECT.PS1.001.096 | |
4-Nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate | Sigma | 71768 | |
Alizarin Red S | Sigma | A5533 | |
Anti-Collagen IV antibody | Abcam | ab6311 | |
Anti-Laminin 1+2 antibody | Abcam | ab7463 | |
Automated plate washer | Agilent Biotek | ELχ50 | |
Automated washer/dispenser | Agilent Biotek | MULTIFLO FX equipped with a peristaltic pump 5uL cassette | |
Bevacizumab | Evidentic | ID PS-E07-2019-00119 A009 | |
BMP-2 | Peprotech | 120-02C | |
BSA | AppliChem | A1391 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5415 R | To centrifuge 2 mL tubes at 16100 x g during ALP analysis |
Confocal laser scanning microscope | Leica | Stellaris 5 | |
Conical 50 mL centrifuge tubes | TPP | 91050 | |
DAPI | Sigma | D9542 | |
DyLight 649 Donkey anti-rabbit IgG (minimal x-reactivity) Antibody | Biolegend | 406406 | |
DyLight 649 Goat anti-mouse IgG (minimal x-reactivity) Antibody | Biolegend | 405312 | |
EGM-2 | Lonza | CC-3162 | |
Epifluorescence microscope | Leica | DMI6000B | |
FBS | Gibco | 10500-064 | |
FGF-2 | Peprotech | 100-18B | |
Fibronectin (IST-9) | Santa Cruz | sc-59826 | |
GFP-HUVECs | PELOBiotech | PB-CAP-0001GFP | |
hBM-MSCs | – | – | Isolated at University Hospital Basel; Papadimitropoulos A, Piccinini E, Brachat S, et al. Expansion of human mesenchymal stromal cells from fresh bone marrow in a 3D scaffold-based system under direct perfusion. PLoS One. 2014;9(7):e102359 |
Inverted microscope | Zeiss | 200M | |
Magnesium chloride | Sigma | M8266 | |
MDA-MB-231 breast cancer cell line | – | Kindly obtained from J Massagué at the Memorial Sloan-Kettering Cancer Center | |
MEMα | Gibco | 22571-038 | |
Multimode imaging reader | Agilent Biotek | Cytation 1 | For automated imaging |
Multimode imaging reader – fluorescence and absorbance | Agilent Biotek | Cytation 5 | For measuring absorbance and fluorescence intensity duing ALP analysis |
Paraformaldehyde | Artechemis | US 040 | |
PBS | Gibco | 10010-015 | |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
Phalloidin-rhodamine | Invitrogen | R415 | |
Picro-Sirius Red Solution | Abcam | ab246832 | |
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit | ThermoFisher Scientific | P7589 | |
Recombinant Anti-Collagen I antibody | Abcam | ab260043 | |
SIGMAFAST BCIP/NBT | Sigma | B5655-25TAB | |
Sodium hydroxide | Sigma | 1064981000 | |
Sodium phosphate dibasic, anhydrous | Sigma | S-0876 | |
Sodium phosphate monobasic, monohydrate | Merck | 1.06346 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
Tween20 | AppliChem | A4974 | |
U2OS osteosarcoma cell line | – | Kindly obtained from J Snedeker at the Institute for Biomechanics, Zurich | |
α-trehalose dihydrate | Sigma | 90208 |