실험적 자가면역 뇌척수염 동안 자가항원의 면역원성을 향상시키는 Mycobacterium paratuberculosis 의 보조 활성
Summary
여기에서 우리는 열로 사멸된 Mycobacterium avium 아종 paratuberculosis를 포함하는 불완전한 Freund’s adjuvant에 현탁된 면역원성 에피토프 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질(MOG)35-55를 사용하여 C57BL/6 마우스에서 실험적 자가면역 뇌척수염을 적극적으로 유도하는 대체 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
미엘린 희소돌기아교세포 당단백질 (MOG)에 의해 유도된 실험적 자가면역 뇌척수염 (EAE)은 불활성화된 결핵균을 함유하는 완전 프로인트 보조제 (CFA)에서 유화된 MOG 펩티드에 의한 면역화를 필요로 한다. 마이코박테리움의 항원 성분은 수지상 세포를 활성화하여 T 세포를 자극하여 톨 유사 수용체를 통해 Th1 반응을 촉진하는 사이토카인을 생성합니다. 그러므로, 항원 챌린지 동안 존재하는 마이코박테리아의 양 및 종은 EAE의 발달과 직접적으로 관련된다. 이 방법 논문은 열-사멸된 Mycobacterium avium 아종 paratuberculosis 균주 K-10을 함유하는 변형된 불완전 프로인트 보조제를 사용하여 C57BL/6 마우스에서 EAE를 유도하는 대안적인 프로토콜을 제시한다.
Mycobacterium avium 복합체의 구성원인 M. paratuberculosis는 반추 동물에서 요네병의 원인 물질이며 다발성 경화증을 포함한 여러 인간 T 세포 매개 장애의 위험 인자로 확인되었습니다. 전반적으로, Mycobacterium paratuberculosis로 면역화 된 마우스는 동일한 용량의 M. tuberculosis H37Ra를 함유 한 CFA로 예방 접종 된 마우스보다 조기 발병 및 더 큰 질병 중증도를 보였다. Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP) 균주 K-10의 항원 결정인자는 훨씬 더 많은 수의 T-림프구(CD4+ CD27+), 수지상 세포(CD11c+ IA/I-E+) 및 단핵구(CD11b+ CD115+) CFA로 면역화 된 마우스와 비교하여 비장에서. 또한, MOG 펩티드에 대한 증식성 T 세포 반응은 M. paratuberculosis-면역화된 마우스에서 가장 높은 것으로 나타났다. 제형 중의 M. paratuberculosis를 함유하는 보조제에서 유화된 뇌파리토겐 (예를 들어, MOG35-55)의 사용은 EAE의 유도 단계 동안 미엘린 에피토프-특이적 CD4+ T-세포를 프라이밍하기 위한 수지상 세포를 활성화시키기 위한 대안적이고 검증된 방법일 수 있다.
Introduction
실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)은 인간 탈수초성 장애 연구를 위한 일반적인 모델이다1. EAE의 몇몇 모델들이 존재한다: 강력한 보조제와 조합된 상이한 미엘린 펩티드를 사용하는 능동 면역화, 미엘린-특이적 CD4+ 림프구의 시험관내 전달에 의한 수동 면역화, 및 자발적EAE2의 트랜스제닉 모델. 이들 모델 각각은 발병기, 이펙터 단계 또는 만성 단계와 같은 EAE의 상이한 양태가 연구될 수 있도록 하는 특정 특징을 갖는다. EAE의 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질 (MOG) 모델은 단핵 염증 침윤, 말초 백질에서의 탈수초화, 및 질환 피크1 후 회복 감소를 특징으로 하기 때문에 만성 신경염증 및 탈수초화의 면역 매개 메커니즘을 연구하기에 좋은 모델이다.
MOG-EAE는 완전한 프로인트 보조제(CFA)에서 펩티드 MOG35-55 로 감수성 마우스를 면역화한 후, 백일해 독소를 복강내 주사함으로써 유도된다. 이것은 혈액뇌장벽의 투과성을 증가시키고 말초에서 활성화된 미엘린 특이적 T-세포가 중추신경계(CNS)에 도달하여 재활성화되도록 한다3. CFA는 항원 제시 세포에 의한 항원 흡수 및 체액 및 세포 매개 반응과 관련된 사이토카인의 발현을 향상시킴으로써 EAE의 유도에 핵심적인 역할을 한다4. 이 메커니즘은 주로 오일에 유화 된 사멸 된 Mycobacterium tuberculosis 의 존재에 기인하며, 그 성분은 면역계에 강한 자극을 제공한다5. 실제로, EAE의 유도는 항원 챌린지 동안 존재하는 마이코박테리움의 양과 직접적으로 관련된다6.
불완전한 프로인트 보조제7 및 보조제 조합8의 효과에 마이코박테리움 부티리쿰(Mycobacterium butyricum)과 같은 다른 사멸된 마이코박테리아를 첨가하는 것은 EAE의 임상 경과를 조절할 수 있고 결과적으로 결과의 재현성에 영향을 미칠 수 있다. 반추동물에서 요네병의 병인인 Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis(MAP)는 인간CNS의 염증성 질환과 관련이 있는데, 이는 항원 성분이 다발성 경화증 및 시신경 척수염 스펙트럼 장애 환자에서 강력한 체액 및 세포 매개 반응을 유도할 수 있기 때문이다9. 따라서 이 프로토콜에서는 CFA의 M. tuberculosis를 M. paratuberculosis로 대체하여 MOG-EAE를 유도하는 대안적이고 재현 가능한 방법을 보여줍니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
본 발명자들은 M. paratuberculosis10을 함유하는 보조제에서 에멀젼화된 펩티드 MOG35-55를 사용하여 C57BL/6J 마우스에서 중증 EAE를 능동적으로 유도하는 강력한 대안 프로토콜을 입증하였다. 이 방법에 의한 EAE의 유도는 CFA와의 일반적인 프로토콜에 의해 유도된 것보다 더 심각한 질환을 초래하였다. 이 차이는 마이코박테리아11의 세포벽에 있는 다른 ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 일본 과학 진흥 협회 (보조금 번호)의 지원을 받았다. JP 23K14675)를 참조하십시오.
Materials
| anti-mouse CD115 antibody | Biolegend, USA | 135505 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD11b antibody | Biolegend, USA | 101215 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD11c antibody | Biolegend, USA | 117313 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD16/32 antibody | Biolegend, USA | 101302 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD4 antibody | Biolegend, USA | 116004 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD8a antibody | Biolegend, USA | 100753 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse I-A/I-E antibody | Biolegend, USA | 107635 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse Ly-6C antibody | Biolegend, USA | 128023 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| BBL Middlebrook OADC Enrichment | Thermo Fisher Scientific, USA | BD 211886 | for isolation and cultivation of mycobacteria |
| C57BL/6J mice | Charles River Laboratory, Japan | 3 weeks old, male and female | |
| FBS 10279-106 | Gibco Life Techologies, USA | 42F9155K | for cell culture, warm at 37 °C before use |
| Freeze Dryer machine | Eyela, Tokyo, Japan | FDU-1200 | for bacteria lyophilization |
| incomplete e Freund’s adjuvant | Difco Laboratories, MD, USA | 263810 | for use in adjuvant |
| Middlebrook 7H9 Broth | Difco Laboratories, MD, USA | 90003-876 | help in the growth of Mycobacteria |
| Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10 | ATCC, USA | BAA-968 | bacteria from bovine origin |
| Mycobacterium tuberculosis H37 Ra, Desiccated | BD Biosciences, USA | 743-26880-EA | for use in adjuvant |
| Mycobactin J | Allied Laboratory, MO, USA | growth promoter | |
| Myelin Oligodendrocyte Glycolipid (MOG) 35-55 | AnaSpec, USA | AS-60130-10 | encephalotigenic peptide |
| Ovalbumin (257-264) | Sigma-Aldrich, USA | S7951-1MG | negative control antigen for proliferative assay |
| pertussis toxin solution | Fujifilm Wako, Osaka Japan | 168-22471 | From gram-negative bacteria Bordetella pertussi, increases blood-brain barrier permeability |
| Polytron homogenizer PT 3100 | Kinematica | for mixing the antigen with the adjuvant | |
| RPMI 1640 with L-glutamine | Gibco Life Techologies, USA | 11875093 | For cell culture |
| Thymidine, [Methyl-3H], in 2% ethanol, 1 mCi | PerkinElmer, Waltham, MA, USA | NET027W001MC | for proliferation assay, use (1 μCi/well) |
| Zombie NIR Fixable Viability Kit | Biolegend, USA | 423105 | cytofluorimetry, for cell viability |
Referências
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