Neste estudo, uma aplicação de dot-blot foi projetada para detectar Leptospira dos três clados principais em amostras de água. Este método permite a identificação de quantidades mínimas de DNA especificamente direcionadas por uma sonda marcada com digoxigenina, facilmente detectada por um anticorpo anti-digoxigenina. Essa abordagem é uma ferramenta valiosa e satisfatória para fins de triagem.
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Artigo de método
Reação em cadeia da polimerase e hibridização de ponto-blot para detecção de Leptospira em amostras de água
Neste artigo
Resumo
Resumo
O dot-blot é uma técnica simples, rápida, sensível e versátil que permite a identificação de quantidades mínimas de DNA especificamente direcionadas pela hibridização da sonda na presença de DNA transportador. Baseia-se na transferência de uma quantidade conhecida de DNA para um suporte sólido inerte, como uma membrana de náilon, utilizando o aparelho de dot-blot e sem separação eletroforética. As membranas de nylon têm a vantagem de alta capacidade de ligação de ácidos nucleicos (400 μg/cm2), alta resistência e são carregadas positiva ou neutramente. A sonda usada é um fragmento de ssDNA altamente específico de 18 a 20 bases marcadas com digoxigenina (DIG). A sonda se conjugará com o DNA da Leptospira . Uma vez que a sonda tenha hibridizado com o DNA alvo, ela é detectada por um anticorpo anti-digoxigenina, permitindo sua fácil detecção por meio de suas emissões reveladas em um filme de raios-X. Os pontos com uma emissão corresponderão aos fragmentos de DNA de interesse. Este método emprega a marcação não isotópica da sonda, que pode ter uma meia-vida muito longa. A desvantagem deste imunomarcador padrão é uma sensibilidade mais baixa do que as sondas isotópicas. No entanto, é mitigado pelo acoplamento da reação em cadeia da polimerase (PCR) e ensaios de dot-blot. Essa abordagem permite o enriquecimento da sequência alvo e sua detecção. Além disso, pode ser usado como uma aplicação quantitativa quando comparado com uma diluição em série de um padrão bem conhecido. Uma aplicação de dot-blot para detectar Leptospira dos três clados principais em amostras de água é apresentada aqui. Esta metodologia pode ser aplicada a grandes quantidades de água, uma vez que tenham sido concentradas por centrifugação para fornecer evidências da presença de DNA de Leptospira. Esta é uma ferramenta valiosa e satisfatória para fins gerais de triagem, podendo ser utilizada para outras bactérias não cultiváveis que possam estar presentes na água, melhorando a compreensão do ecossistema.
Introdução
A leptospirose em humanos tem origem principalmente em fontes ambientais 1,2. A presença de Leptospira em lagos, rios e córregos é um indicador de transmissão de leptospirose entre animais silvestres e animais domésticos e de produção que podem eventualmente entrar em contato com esses corpos d'água 1,3,4. Além disso, Leptospira foi identificada em fontes não naturais, incluindo esgoto, água estagnada e água da torneira 5,6.
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Protocolo
1. Preparação da amostra
- Concentre cada amostra de água em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL por centrifugação a 8.000 x g por 10 min a 4 ° C. Repita esta etapa, quantas vezes forem necessárias, para concentrar a amostra em um volume de 250 μL.
- Use o kit de extração de DNA de acordo com as instruções do fabricante (consulte a Tabela de Materiais).
- Realize a PCR específica de acordo com a sonda dot-blot que será utilizada (Tabela 1).
- Realizar as amplificações em tubos de PCR com o volume final de 25 μL contendo 1 tampão X, 2,5 unidades de Taq polimerase, 1 μM de cada prim....
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Resultados
Para avaliar a eficácia da técnica, foi utilizado DNA genômico de culturas puras de cada sorovar de Leptospira , juntamente com a sonda específica do clado. As membranas foram preparadas com 100 ng de DNA genômico por reação de PCR para cada sorovar, seguido por oito DNA genômico de bactérias não relacionadas e concentrações variáveis de DNA genômico dos sorovares ad hoc de Leptospira . Cada ensaio incluiu controle positivo, negativo e sem modelo. Esses DNAs genômicos não relacionados não mostraram afin.......
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Discussão
As etapas críticas da técnica de dot-blot incluem (1) imobilização de DNA, (2) bloqueio dos locais de ligação livres na membrana com DNA não homólogo, (3) a complementaridade entre a sonda e o fragmento alvo sob condições de recozimento, (4) remoção da sonda não hibridizada e (5) a detecção da molécula repórter41.
O PCR-Dot-blot tem certas limitações, como a técnica não fornece informações sobre o tamanho do fragmento hibridizado37, requer deshib.......
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Divulgações
Os autores declaram não haver conflito de interesses.
Agradecimentos
Estamos em dívida com a coleção Leptospira do Departamento de Microbiologia e Imunologia da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade Nacional Autônoma do México. Agradecemos a generosa doação das cepas de referência de Leptospira ; Leptospira fainei sorovar Hurstbridge cepa BUT6 e Leptospira biflexa sorovar Patoc cepa Patoc I para o Dr. Alejandro de la Peña Moctezuma. Agradecemos ao Dr. José Antonio Ocampo Cervantes, Coordenador do CIBAC, e ao pessoal pelo apoio logístico. A EDT estava no âmbito do programa Terminal Project para alunos de graduação da Universidade Autônoma Metropolitana-Campus Cuaji....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| REAGENTES | |||
| Kit de extração de DNA Purelink | Invitrogen | K182002 | |
| Gotaq Flexi DNA Polimerase (kit de polimerase Taq de PCR de ponto final) | Promega | M3001 | |
| Whatman, grau 1, | membranas de nylon Merk | WHA1001325 | |
| , carregado positivamente Rolo 30cm x 3 m | Roche | ||
| Anti-Digoxigenina-AP, fragmentos Fab Ovino Policlonal Anticorpo primário | Roche | 11093274910 | |
| Base Média EMJH | Difco | S1368JAA | |
| Leptospira Enriquecimento EMJH | Difco | BD 279510 | |
| Reagente de bloqueio | Roche | 11096176001 | |
| CSPD pronto para uso 3-(4-metoxispiro {1,2-dioxetano-3,2′-(5′-cloro) triciclo-[3.3.1.13,7] decanto}8-4-il) fenil fosfato | Merk | 11755633001 | |
| Ácido desoxirribonucléico do esperma do arenque | Sigma Aldrich | D3159 | |
| Desenvolvedor Carestream | Carestream Health Inc | GBX5158621 | |
| Digoxigenina-11-ddUTP | Roche | 11363905910 | |
| EDTA, Sal Dissódico (Di-hidratado) | Promega | H5032 | |
| Ficoll 400 | Sigma Aldrich | F8016 | |
| Fixador Carestream Carestream | Health Inc | GBX 5158605 | |
| Lauril sulfato Sal de Sódio (Dodecil sulfato de sódio; SDS) C12H2504SNa | Sigma Aldrich | L5750 | |
| N-Lauroilsarcosina sal de sódio CH3(CH2)10CON(CH3) CH2COONa | Sigma Aldrich | L-9150 | É um surfactante aniônico |
| Polivinilpirrolidona (PVP-40) | Sigma Aldrich | PVP40 | |
| Polietilenoglicol Monolaurato de sorbitano (Tween 20) | Sigma Aldrich | 9005-64-5 | |
| Cloreto de sódio (NaCl) | Sigma Aldrich | 7647-14-5 | |
| Dodecil sulfato de sódio (SDS) | Sigma Aldrich | 151-21-3 | |
| Hidróxido de sódio (NaOH) | Sigma Aldrich | 1310-73-2 | |
| Fosfato de sódio dibásico (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | 7558-79-4 | |
| Transferase terminal, cloridrato | Tris Roche | 3289869103 | |
| (Tris HCl) | Sigma-Aldrich | 1185-53-1 | |
| SSPE 20X | Sigma-Aldrich | S2015-1L | Pode ser feito em casa seguindo Arquivo Suplementar 6 |
| Primers | Sigma-Aldrich | Sob demanda | Siga a tabela 1 |
| Sondas | Sigma-Aldrich | Sob demanda | Siga a tabela 1 |
| Equipment | |||
| Nanodrop™ Um Espectrofotômetro | Thermo-Scientific | ND-ONE-W | |
| Microcentrífuga refrigerada Sigma 1-14K, adequada para centrifugação de tubos de microcentrífuga de 1,5 ml a 14.000 rpm | Sigma-Aldrich | 1-14K | |
| , faixa 2-20 µ l, 20-200 µ l | Gilson | SKU:F167360 | |
| Tubos de microcentrífuga descartáveis de 1,5 ml (autoclavados) | Axygen | MCT-150-SP | |
| Descartáveis 600 µ l tubos de microcentrífuga (autoclavados) | Axygen | 3208 | |
| 1-10 µ l | Axygen | T-300 | |
| 1-200 µ l | Aparelho Axygen | TR-222-Y | |
| Dot-Blot Bio-Dot | BIORAD | 1706545 | |
| Portátil Hergom Sucção Hergom | 7E-A | ||
| Caixa de Luz Científica (Luz Visível PH90-115V) | Hoefer | PH90-115V | |
| UV Crosslinker | Hoefer | UVC-500 | |
| Thermo Hybaid PCR Express Thermocycler | Hybaid | ||
| radiográfico com placa IP14 X 17 | Fuji |
Referências
- Bierque, E., Thibeaux, R., Girault, D., Soupé-Gilbert, M. E., Goarant, C. A systematic review of Leptospira in water and soil environments. PLOS One. 15 (1), e0227055(2020).
- Haake, D. A., Levett, P. N. Leptospirosis in humans. Current Topics in Microbiology and Immunology. 387
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Reimpressões e permissões
