Microkolonievormende eenheidstest voor evaluatie van de werkzaamheid van vaccins tegen tuberculose
Summary
De bepaling van kolonievormende eenheden (CFU) is de gouden standaardtechniek voor het kwantificeren van bacteriën, waaronder Mycobacterium tuberculosis, die weken nodig heeft om zichtbare kolonies te vormen. Hier beschrijven we een micro-CFU voor CFU-bepaling met verhoogde tijdsefficiëntie, lagere laboratoriumruimte en reagenskosten, en schaalbaarheid voor experimenten met gemiddelde en hoge doorvoer.
Abstract
Tuberculose (tbc), wereldwijd de belangrijkste doodsoorzaak door een infectieus agens, doodde in 2022 1,6 miljoen mensen en werd alleen overtroffen door COVID-19 tijdens de pandemie van 2019-2021. De ziekte wordt veroorzaakt door de bacterie Mycobacterium tuberculosis (M.tb). De Mycobacterium bovis-stam Bacillus Calmette-Guérin (BCG), het enige tbc-vaccin, is het oudste goedgekeurde vaccin ter wereld dat nog steeds in gebruik is. Momenteel zijn er 12 vaccins in klinische proeven en tientallen vaccins in preklinische ontwikkeling. De voorkeursmethode die wordt gebruikt om de werkzaamheid van tbc-vaccins in preklinische onderzoeken te beoordelen, is de telling van bacteriekolonies door middel van de kolonievormende eenheden (CFU)-test. Deze tijdrovende test duurt 4 tot 6 weken, vereist aanzienlijke laboratorium- en incubatorruimte, heeft hoge reagenskosten en is gevoelig voor contaminatie. Hier beschrijven we een geoptimaliseerde methode voor kolonietelling, de micro-CFU (mCFU), die een eenvoudige en snelle oplossing biedt om de werkzaamheidsresultaten van het M.tb-vaccin te analyseren. De mCFU-test vereist tien keer minder reagentia, verkort de incubatietijd met een factor drie, duurt 1 tot 2 weken om te voltooien, vermindert de laboratoriumruimte en de reagenskosten en minimaliseert de gezondheids- en veiligheidsrisico’s die gepaard gaan met het werken met grote aantallen M.tb. Om de werkzaamheid van een tbc-vaccin te evalueren, kunnen bovendien monsters worden verkregen uit verschillende bronnen, waaronder weefsels van gevaccineerde dieren die besmet zijn met mycobacteriën. We beschrijven ook een geoptimaliseerde methode om een eencellige, uniforme en hoogwaardige mycobacteriële cultuur te produceren voor infectiestudies. Ten slotte stellen we voor dat deze methoden universeel worden toegepast voor preklinische studies naar de bepaling van de werkzaamheid van vaccins, wat uiteindelijk leidt tot tijdsbesparing bij de ontwikkeling van vaccins tegen tuberculose.
Introduction
Tuberculose (tbc) is wereldwijd de belangrijkste doodsoorzaak door een enkel infectieus agens, bacterie Mycobacterium tuberculosis (M.tb), die meer mensen doodt dan welke andere ziekteverwekker dan ook. In 2021 was tuberculose verantwoordelijk voor 1,6 miljoen sterfgevallen en werd het overtroffen door COVID-19 tijdens de pandemie van 2019-20211. Bovendien was volgens het wereldwijde tbc-rapport van de Wereldgezondheidsorganisatie van 2022 de COVID-19-pandemie verantwoordelijk voor een toename van nieuwe tbc-gevallen. De WHO meldt ook grote dalingen in het aantal mensen met de diagnose tbc in deze periode, waardoor het aantal tbc-gevallenverder zou kunnen toenemen.
De Bacillus Calmette-Guérin (BCG) is een levend verzwakte stam van de pathogene Mycobacterium bovis, die meer dan 100 jaar geleden voor het eerst als vaccin werd gebruikt. Dit is het enige vaccin tegen tuberculose en is het oudste goedgekeurde vaccin ter wereld dat nog steeds in gebruik is 2,3. Momenteel zijn er 12 vaccins in verschillende fasen van klinische proeven4, en tientallen vaccins zijn in preklinische ontwikkeling 5,6. Preklinische beoordeling van vaccins tegen tuberculose omvat de evaluatie van de veiligheid en immunogeniciteit7, die kan worden verkregen in diverse diermodellen zoals zebravissen, muizen, cavia’s, konijnen, runderen en niet-menselijke primaten 8,9,10. Bovendien vereist het beoordelen van het vermogen van een vaccin om bescherming te induceren tegen M.tb-infectie en/of -overdracht, d.w.z. de werkzaamheid van het vaccin, een M.tb-provocatie in vivo 5,11. Interessant is dat BCG-vaccinatie niet-specifieke effecten induceert die de overleving van andere bacteriële en virale pathogenen beïnvloeden12,13 via het mechanisme van getrainde immuniteit14. Om de levensvatbare bacteriële belasting in een besmet dier te kwantificeren, is de voorkeursmethode de telling van bacteriekolonies door middel van de kolonievormende eenheden (CFU) assay 5,15. CFU is een eenheid die een schatting maakt van het aantal micro-organismen (bacteriën of schimmels) dat kolonies vormt onder specifieke groeiomstandigheden. CFU’s zijn afkomstig van levensvatbare en replicatieve micro-organismen, en het absolute aantal levende micro-organismen in elke kolonie is moeilijk in te schatten. Het is onzeker of een kolonie is ontstaan uit één of meerdere micro-organismen. De CFU-eenheid weerspiegelt deze onzekerheid, vandaar dat er een grote variabiliteit kan worden waargenomen in replicaten van hetzelfde monster. Deze tijdrovende test vereist gespecialiseerde technici die zijn opgeleid om te werken in een faciliteit van bioveiligheidsniveau 3 (BSL3), een aanzienlijk laboratorium en incubatorruimte, duurt 4 tot 6 weken en is vatbaar voor besmetting.
In deze studie beschrijven we een geoptimaliseerde methode voor kolonietelling, de micro-CFU (mCFU), en bieden we een eenvoudige en snelle oplossing om de resultaten 15,16,17,18,19,20 te analyseren. De mCFU-test vereist tien keer minder reagentia, verkort de incubatietijd met een factor drie, duurt 1 tot 2 weken om te voltooien, vermindert de laboratoriumruimte en de reagenskosten en minimaliseert de gezondheids- en veiligheidsrisico’s die gepaard gaan met het werken met grote aantallen M.tb. We stellen voor dat deze methode universeel wordt toegepast voor preklinische studies naar het bepalen van de werkzaamheid van vaccins, wat uiteindelijk leidt tot een tijdsbesparing in de ontwikkeling van vaccins tegen tuberculose. Ten slotte is deze geoptimaliseerde methode van CFU-telling gebruikt om niet alleen mycobacteriën te kwantificeren, maar ook andere bacteriën, zoals Escherichia coli en Ralstonia solanacearum21.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tbc is een belangrijk probleem voor de volksgezondheid dat steeds belangrijker wordt, vooral in lage- en middeninkomenslanden. De verstoring van zorginstellingen voor het diagnosticeren en behandelen van tuberculose tijdens de COVID-19-pandemie had een negatief effect op de incidentie van nieuwe gevallen1. Bovendien moeten de multi-drug en extensief resistente M.tb-stammen en de co-infectie van M.tb en HIV dringend worden aangepakt om deze epidemie onder controle te krijgen<sup c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door interne financiering van de Faculteit der Geneeskunde, Universidade Católica Portuguesa, en externe financiering van Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), in het kader van de subsidies UIDP/04279/2020, UIDB/04279/2020 en EXPL/SAU-INF/0742/2021.
Materials
| 96-well plates | VWR | 734-2781 | |
| DSLR 15-55 mm lens | Nikon | AF-P DX NIKKOR 18-55mm f/3.5-5.6G VR | |
| DSLR camera | Nikon | D3400 | |
| DSLR macro lens | Sigma | MACRO 105mm F2.8 EX DG OS HSM | |
| Fetal calf serum | Gibco | 10270106 | |
| Fiji Software | https://fiji.sc/ | Fiji is an open-source software supported by several laboratories, institutions, and individuals. All the required plugins are included. | |
| Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich | 18896 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Middlebrook 7H10 | BD | 262710 | |
| Middlebrook 7H9 | BD | 271310 | |
| Multichannel pipette (0.5 – 10 µl) | Gilson | FA10013 | |
| Multichannel pipette (20 – 200 µl) | Gilson | FA10011 | |
| Mycobacterium bovis BCG | American Type Culture Collection | ATCC35734 | strain TMC 1011 [BCG Pasteur] |
| OADC enrichment | BD | 211886 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | NZYTech | MB25201 | |
| RPMI 1640 medium | Gibco | 21875091 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Spectrophotometer UV-6300PC | VWR | 634-6041 | |
| Square Petri dish 120 x 120 mm | Corning | BP124-05 | |
| Tyloxapol | Sigma-Aldrich | T8761 | |
| Ultrasound bath Elma P 30 H | VWR | 142-0051 |
References
- World Health Organization. . Global Tuberculosis Report 2022. , (2022).
- Bettencourt, P. J. G., Joosten, S. A., Lindestam Arlehamn, C. S., Behr, M. A., Locht, C., Neyrolles, O. 100 years of the Bacillus Calmette-Guérin vaccine. Vaccine. 39 (50), 7221-7222 (2021).
- Bettencourt, P. J. G. The 100th anniversary of bacille Calmette-Guérin (BCG) and the latest vaccines against COVID-19. The International Journal of Tuberculosis and Lung Disease. 25 (8), 611-613 (2021).
- Scriba, T. J., Netea, M. G., Ginsberg, A. M. Key recent advances in TB vaccine development and understanding of protective immune responses against Mycobacterium tuberculosis. Seminars in Immunology. 50, 101431 (2020).
- McShane, H., Williams, A. A review of preclinical animal models utilised for TB vaccine evaluation in the context of recent human efficacy data. Tuberculosis. 94 (2), 105-110 (2014).
- Voss, G., et al. Progress and challenges in TB vaccine development. F1000Research. 7, 199 (2018).
- Satti, I., McShane, H. Current approaches toward identifying a correlate of immune protection from tuberculosis. Expert Review of Vaccines. 18 (1), 43-59 (2019).
- Young, D. Animal models of tuberculosis. European Journal of Immunology. 39 (8), 2011-2014 (2009).
- Pedroza-Roldán, C., Flores-Valdez, M. A. Recent mouse models and vaccine candidates for preventing chronic/latent tuberculosis infection and its reactivation. Pathogens and disease. 75 (6), (2017).
- Gong, W., Liang, Y., Wu, X. Animal Models of Tuberculosis Vaccine Research: An Important Component in the Fight against Tuberculosis. BioMed Research International. 2020, 1-21 (2020).
- Bettencourt, P., et al. Identification of antigens presented by MHC for vaccines against tuberculosis. NPJ vaccines. 5 (1), 2 (2020).
- Moorlag, S. J. C. F. M., Arts, R. J. W., van Crevel, R., Netea, M. G. Non-specific effects of BCG vaccine on viral infections. Clinical Microbiology and Infection. 25 (12), 1473-1478 (2019).
- Wilkie, M., et al. Functional in-vitro evaluation of the non-specific effects of BCG vaccination in a randomised controlled clinical study. Scientific Reports. 12 (1), 7808 (2022).
- Netea, M. G., et al. Trained immunity: A program of innate immune memory in health and disease. Science. 352 (6284), aaf1098 (2016).
- Bettencourt, P., Pires, D., Carmo, N., Anes, E. Application of Confocal Microscopy for Quantification of Intracellular Mycobacteria in Macrophages. Microscopy: Science, Technology, Applications and Education. 1, 614-621 (2010).
- Bettencourt, P., Carmo, N., Pires, D., Timóteo, P., Anes, E. Mycobacterial infection of macrophages: the effect of the multiplicity of infection. Antimicrobial research: Novel bioknowledge and educational programs. , 651-664 (2017).
- Pires, D., Bettencourt, P., Carmo, N., Niederweis, M., Anes, E. Role of Mycobacterium tuberculosis outer-membrane porins in bacterial survival within macrophages. Drug Discovery Today. 15 (23-24), 1112-1113 (2010).
- Pires, D., et al. Mycobacterium tuberculosis Modulates miR-106b-5p to Control Cathepsin S Expression Resulting in Higher Pathogen Survival and Poor T-Cell Activation. Frontiers in immunology. 8 (DEC), 1819 (2017).
- Pires, D., et al. Role of Cathepsins in Mycobacterium tuberculosis Survival in Human Macrophages. Scientific reports. 6 (August), 32247 (2016).
- Bettencourt, P., et al. Actin-binding protein regulation by microRNAs as a novel microbial strategy to modulate phagocytosis by host cells: the case of N-Wasp and miR-142-3p. Frontiers in cellular and infection microbiology. 3 (June), 19 (2013).
- Bhuyan, S., et al. Microliter spotting and micro-colony observation: A rapid and simple approach for counting bacterial colony forming units. Journal of Microbiological Methods. 207, 106707 (2023).
- Jackson, S., McShane, H. Challenges in Developing a Controlled Human Tuberculosis Challenge Model. Current topics in microbiology and immunology. , 1-27 (2022).
- Darrah, P. A., et al. Prevention of tuberculosis in macaques after intravenous BCG immunization. Nature. 577 (7788), 95-102 (2020).
- Madura Larsen, J., et al. BCG stimulated dendritic cells induce an interleukin-10 producing T-cell population with no T helper 1 or T helper 2 bias in vitro. Immunology. 121 (2), 276-282 (2007).
- Bickett, T. E., et al. Characterizing the BCG-Induced Macrophage and Neutrophil Mechanisms for Defense Against Mycobacterium tuberculosis. Frontiers in immunology. 11, 1202 (2020).
- Pires, D., et al. Interference of Mycobacterium tuberculosis with the endocytic pathways on macrophages and dendritic cells from healthy donors: role of cathepsins. Drug Discovery Today. 15 (23-24), 1112-1112 (2010).
- Betts, G., et al. Optimising Immunogenicity with Viral Vectors: Mixing MVA and HAdV-5 Expressing the Mycobacterial Antigen Ag85A in a Single Injection. PLoS ONE. 7 (12), e50447 (2012).
- Tanner, R., et al. The influence of haemoglobin and iron on in vitro mycobacterial growth inhibition assays. Scientific reports. 7 (1), 43478 (2017).
- McNeill, E., et al. Regulation of mycobacterial infection by macrophage Gch1 and tetrahydrobiopterin. Nature communications. 9 (1), 5409 (2018).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Pereira, M., Vale, N. Saquinavir: From HIV to COVID-19 and Cancer Treatment. Biomolecules. 12 (7), 944 (2022).
- Pires, D., et al. Repurposing Saquinavir for Host-Directed Therapy to Control Mycobacterium Tuberculosis Infection. Frontiers in immunology. 12, 647728 (2021).
- Pires, D., et al. Liposomal Delivery of Saquinavir to Macrophages Overcomes Cathepsin Blockade by Mycobacterium tuberculosis and Helps Control the Phagosomal Replicative Niches. International journal of molecular sciences. 24 (2), (2023).
- Maartens, G., Wilkinson, R. J. Tuberculosis. The Lancet. 370 (9604), 2030-2043 (2007).
- Matarazzo, L., Bettencourt, P. J. G. mRNA vaccines: a new opportunity for malaria, tuberculosis and HIV. Frontiers in Immunology. 14, 1172691 (2023).
- Young, D., Dye, C. The Development and Impact of Tuberculosis Vaccines. Cell. 124 (4), 683-687 (2006).
- Kommareddi, S., Abramowsky, C. R., Swinehart, G. L., Hrabak, L. Nontuberculous mycobacterial infections: Comparison of the fluorescent auramine-o and Ziehl-Neelsen techniques in tissue diagnosis. Human Pathology. 15 (11), 1085-1089 (1984).
- Sabiiti, W., et al. A Tuberculosis Molecular Bacterial Load Assay (TB-MBLA). Journal of visualized experiments: JoVE. (158), e60460 (2020).
- Somoskövi, A., et al. Comparison of Recoveries of Mycobacterium tuberculosis Using the Automated BACTEC MGIT 960 System, the BACTEC 460 TB System, and Löwenstein-Jensen Medium. Journal of Clinical Microbiology. 38 (6), 2395-2397 (2000).
- Tanner, R., et al. The in vitro direct mycobacterial growth inhibition assay (MGIA) for the early evaluation of TB vaccine candidates and assessment of protective immunity: a protocol for non-human primate cells. F1000Research. 10, 257 (2021).
