فحص الأدوية القائمة على الخلايا لمثبطات الالتهام الذاتي ذات الصلة 4B السيستين الببتيداز
Summary
هنا ، نصف بروتوكولا مفصلا لاستخدام مقايسة المراسل المستندة إلى luciferase في تنسيق فحص شبه آلي عالي الإنتاجية.
Abstract
أظهرت أدلة متزايدة أن التدفق الذاتي العالي مرتبط بتطور الورم ومقاومة علاج السرطان. يعد فحص بروتينات الالتهام الذاتي الفردية شرطا أساسيا للاستراتيجيات العلاجية التي تستهدف هذا المسار. ثبت أن تثبيط الأنزيم البروتيني ATG4B يزيد من البقاء على قيد الحياة بشكل عام ، مما يشير إلى أن ATG4B يمكن أن يكون هدفا دوائيا محتملا لعلاج السرطان. طور مختبرنا مقايسة انتقائية قائمة على اللوسيفيراز لمراقبة نشاط ATG4B في الخلايا. بالنسبة لهذا الفحص ، يتم وضع علامة على ركيزة ATG4B ، LC3B ، في المحطة C مع لوسيفيراز مفرز من مجدافيات الأرجل البحرية Gaussia princeps (GLUC). يرتبط هذا المراسل بالهيكل الخلوي للأكتين ، وبالتالي يبقيه في سيتوبلازم الخلايا عند فتحه. يؤدي الانقسام بوساطة ATG4B إلى إطلاق GLUC عن طريق إفراز غير تقليدي ، والذي يمكن مراقبته بعد ذلك عن طريق حصاد المواد الطافية من زراعة الخلايا كارتباط لنشاط ATG4B الخلوي. تقدم هذه الورقة تكييف هذا الفحص القائم على لوسيفيراز مع الفحص الآلي عالي الإنتاجية. نحن نصف سير العمل والتحسين للتحليل المثالي عالي الإنتاجية لنشاط ATG4B الخلوي.
Introduction
الالتهام الذاتي هو عملية أيضية محفوظة تسمح للخلايا بالحفاظ على التوازن داخل الخلايا والاستجابة للإجهاد عن طريق تدهور المحتويات الخلوية القديمة أو المعيبة أو غير الضرورية عبر الجسيمات الحالة1،2،3. في ظل بعض الظروف الفيزيولوجية المرضية ، تعمل هذه العملية كاستجابة خلوية حاسمة للحرمان من المغذيات والأكسجين ، مما يؤدي إلى إعادة تدوير العناصر الغذائية والدهون ، مما يسمح للخلايا بالتكيف مع احتياجاتها الأيضية2،3،4. كما تم تحديد الالتهام الذاتي على أنه استجابة إجهاد خلوي تتعلق بالعديد من الأمراض ، مثل الاضطرابات التنكسية العصبية ، وعدوى مسببات الأمراض ، وأنواع مختلفة من السرطان. وظيفة الالتهام الذاتي في السرطان معقدة وتعتمد على نوع الورم ومرحلته وحالته. يمكن أن يثبط تكوين الورم من خلال تدهور الالتهام الذاتي للخلايا التالفة ، ولكن يمكنه أيضا تعزيز بقاء الأورام المتقدمة عن طريق تحسين بقاء الخلايا أثناء الظروف العصيبة ، مثل نقص الأكسجة والحرمان من المغذيات والضرر السام للخلايا2،4،5،6.
أظهرت العديد من الدراسات أن تثبيط الالتهام الذاتي يوفر فائدة كاستراتيجية مضادة للسرطان. وبالتالي ، فإن تثبيط الخطوات الحرجة ، مثل تكوين البلعمة الذاتية أو اندماجها مع الليزوزوم ، يمكن أن يكون وسيلة فعالة للسيطرة على السرطان2،4،5،6. أظهرت الأدلة المتزايدة أن ATG4B متورط في بعض الحالات المرضية ، وقد اكتسب الانتباه كهدف محتمل مضاد للسرطان2،3،4. على سبيل المثال ، لوحظ أن خلايا سرطان القولون والمستقيم وخلايا سرطان الثدي الإيجابية لمستقبلات عامل نمو البشرة البشري 2 (HER2) لديها مستويات تعبير ATG4B أعلى بكثير من الخلايا الطبيعية المجاورة 2,4. في خلايا سرطان البروستاتا ، أدى تثبيط ATG4B إلى قابلية خاصة بخط الخلية للعلاج الكيميائي والعلاج الإشعاعي7. في الآونة الأخيرة ، ظهرت أدلة قوية على أن سرطان البنكرياس الغدي القنوي (PDAC) عرضة بشكل خاص لتثبيط ATG4B. على سبيل المثال ، في نموذج فأر معدل وراثيا ، تبين أن الفقدان المتقطع لوظيفة ATG4B يقلل من نمو ورم PDAC ويزيد من البقاء على قيد الحياة 3,4. بشكل عام ، يتم التعبير عن ATG4B بشكل مفرط في بعض أنواع السرطان ، ويرتبط بتطور الورم ، ويرتبط بمقاومة علاج السرطان2،4،8.
تحتوي بروتياز السيستين ATG4 في الثدييات على أربعة أفراد من العائلة ، ATG4A-ATG4D. تظهر هذه البروتينات بعض الانتقائية المستهدفة تجاه عائلة البروتيناتLC3 / GABARAP (ATG8) 9،10،11 وقد يكون لها وظائف إضافية غير مرتبطة بنشاط البروتياز12،13. علاوة على ذلك ، يعمل ATG4 في تنظيم نوع جديد من التعديل بعد الترجمة ، ATG8-ylation للبروتينات11,12. في حين أن ATG4B وركيزته الرئيسية LC3B هي الأكثر دراسة على نطاق واسع ، تظهر صورة تشير إلى دور معقد لكل فرد من أفراد الفصيلة الفرعية في تنظيم عمليات الالتهام الذاتي وغير الالتهام الذاتي. يتم تأكيد ذلك أيضا من خلال شبكة معقدة من التعديلات اللاحقة للترجمة التي تنظم نشاط ATG4B عن طريق الفسفرة ، والأستلة ، والجليكوزيل ، والنيتروسيل9،10،11،12،13.
تم نشر العديد من مثبطات ATG4B المعروفة2،4،14،15. في حين أن هذه مناسبة كأدوات بحثية ، إلا أن ملفها الدوائي أو انتقائيتها أو قوتها قد منعتها من التطوير كمرشحين قبل سريريين 4,16. بشكل عام ، هناك حاجة ملحة لتحديد مركبات أكثر فعالية وانتقائية. في كثير من الأحيان ، تكون المركبات مثبطات كيميائية حيوية جيدة لوظيفة البروتين ، ومع ذلك فإن فعاليتها في المقايسات القائمة على الخلايا ضعيفة. هناك العديد من المقايسات لمراقبة نشاط ATG4B ، بما في ذلك الطرق الكيميائية الحيوية والمقايسات الخلوية4. لقد طورنا سابقا مقايسة بسيطة قائمة على التلألؤ وعالية الإنتاجية لمراقبة نشاط ATG4B في الخلايا 8,17. يستخدم هذا الفحص بروتين لوسيفيراز من Gaussia princeps (GLUC) مستقر ونشط في الوسط خارج الخلية ويمكن إطلاقه بشكل مستحث من الخلايا استجابة لنشاط التحلل البروتيني ATG4B18,19.
في بناء هذا المراسل ، يرتبط dNGLUC بالهيكل الخلوي للأكتين للخلايا. يمكن إدخال رابط خاص بالبروتياز بين مرساة β-actin و dNGLUC ، مما يجعل الإفراز يعتمد على انقسام الرابط. استخدمنا إطار القراءة المفتوح الكامل الطول ل LC3B بين β-actin و dNGLUC ، حتى نتمكن من مراقبة انقسام LC3B17،18،19. على الرغم من أن آلية إفراز dNGLUC غير مفهومة بشكل جيد ، إلا أنها محددة لمراقبة نشاط ATG4B ، ولا تعتمد على الالتهام الذاتي الكلي كما يحدث في خلايا خروج المغلوب ATG5 ، ويتم بوساطة آليات غير تقليدية لا تتطلب ببتيد إشارة كلاسيكي4،18،19. لقد استخدمنا هذا المراسل بنجاح لفحص الجزيئات الصغيرة ومكتبات siRNA ، وحددنا منظمات جديدة لنشاط ATG4B ، مثل كينازات بروتين Akt8. تصف هذه الورقة بروتوكولا مفصلا لاستخدام مراسل luciferase هذا بتنسيق فحص شبه آلي عالي الإنتاجية.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا البروتوكول مقايسة جين المراسل القائمة على الخلية لتحديد مثبطات ATG4B. يعتمد تحديد النتائج الأولية على نشاط لوسيفيراز عند معالجة الخلايا التي تعبر عن إطار القراءة المفتوح الكامل الطول ل LC3B بين β-actin و dNGLUC. بعض مزايا هذا الفحص هي أنه حساس وكمي للغاية وغير جراحي ، حيث يمكنه اكتشاف dNGLUC دو?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من خلال التمويل الأساسي لمجلس البحوث الطبية في المملكة المتحدة لمنحة وحدة جامعة MRC-UCL المرجع MC_U12266B ، ومنحة منصة MRC للخرف في المملكة المتحدة MR / M02492X / 1 ، وسرطان البنكرياس في المملكة المتحدة (مرجع المنحة 2018RIF_15) ، ومخطط دعم التسريع العلاجي UCL ، بدعم من MRC الثقة في المفهوم 2020 UCL MC / PC / 19054. تم الحصول على ترميز البلازميد ActinLC3dNGLUC (pMOWS-ActinLC3dNGLUC) من الدكتور روبن كيتلر (قسم الطب البشري ، كلية الطب في برلين).
Materials
| 50 µL Disposable Tips – Non-filtered, Pure, Nested 8 Stack (Passive Stack) | Tecan | 30038609 | Disposable 96-tip rack |
| BioTek MultiFlo | BioTek | bulk dispenser | |
| Coelenterazine | Santa Cruz Biotechnology | sc-205904 | substrate |
| Columbus Image analysis software | Perkin Elmer | Version 2.9.1 | image analysis software |
| DPBS (1x) | Gibco | 14190-144 | |
| Echo Qualified 384-Well Polypropylene Microplate, Clear, Non-sterile | Beckman Coulter | 001-14555 | 384PP plate |
| EnVision II | Perkin Elmer | luminescence plate reader | |
| Express pick Library (96-well)-L3600-Z369949-100µL | Selleckchem | L3600 | Selleckchem |
| FMK9A | MedChemExpress | HY-100522 | |
| Greiner FLUOTRAC 200 384 well plates | Greiner Bio-One | 781076 | solid-black 384-well plates |
| Harmony Imaging software | Perkin Elmer | Version 5.1 | imaging software |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate – 10 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher | H3570 | Hoechst 33342 |
| Labcyte Echo 550 series with Echo Cherry Pick software | Labcyte/Beckman Coulter | nanoscale acoustic liquid dispenser | |
| Milli-Q water | deionized water | ||
| Opera Phenix High-Content Screening System | Perkin Elmer | automated microscope | |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | |
| PhenoPlate 384-well, black, optically clear flat-bottom, tissue-culture treated, lids | Perkin Elmer | 6057300 | CellCarrier-384 Ultra PN |
| pMOWS-ActinLC3dNGLUC | Obtained from Dr. Robin Ketteler (Department of Human Medicine, Medical School Berlin) | ||
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Merck | TR-1003-G | polybrene |
| Puromycin dihydrochloride, 98%, Thermo Scientific Chemicals | ThermoFisher | J61278.ME | Puromycin |
| Tecan Freedom EVO 200 robot | Tecan | liquid handling robotic platform | |
| X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent Roche | Merck | 6366244001 | DNA transfection reagent |
Referências
- Kocaturk, N. M., et al. Autophagy as a molecular target for cancer treatment. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 134, 116-137 (2019).
- Fu, Y., et al. Targeting ATG4 in cancer therapy. Cancers. 11 (5), 649 (2019).
- Towers, C. G., Thorburn, A. Therapeutic targeting of autophagy. EBioMedicine. 14, 15-23 (2016).
- Agrotis, A., Ketteler, R. On ATG4B as drug target for treatment of solid tumours-the knowns and the unknowns. Cells. 9 (1), 53 (2019).
- Levy, J. M. M., Towers, C. G., Thorburn, A. Targeting autophagy in cancer. Nature Reviews Cancer. 17 (9), 528-542 (2017).
- Kimmelman, A. C., White, E. Autophagy and tumor metabolism. Cell Metabolism. 25 (5), 1037-1043 (2017).
- Tran, E., et al. Context-dependent role of ATG4B as target for autophagy inhibition in prostate cancer therapy. Biochemical and Biophysical Research Communications. 441 (4), 726-731 (2013).
- Pengo, N., et al. Identification of kinases and phosphatases that regulate ATG4B activity by siRNA and small molecule screening in cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 148 (2018).
- Kauffman, K. J., et al. Delipidation of mammalian Atg8-family proteins by each of the four ATG4 proteases. Autophagy. 14 (6), 992-1010 (2018).
- Tanida, I., Sou, Y. -. S., Minematsu-Ikeguchi, N., Ueno, T., Kominami, E. Atg8L/Apg8L is the fourth mammalian modifier of mammalian Atg8 conjugation mediated by human Atg4B, Atg7 and Atg3. The FEBS Journal. 273 (11), 2553-2562 (2006).
- Agrotis, A., Pengo, N., Burden, J. J., Ketteler, R. Redundancy of human ATG4 protease isoforms in autophagy and LC3/GABARAP processing revealed in cells. Autophagy. 15 (6), 976-997 (2019).
- Nguyen, T. N., et al. Atg8 family LC3/GABARAP proteins are crucial for autophagosome-lysosome fusion but not autophagosome formation during PINK1/Parkin mitophagy and starvation. The Journal of Cell Biology. 215 (6), 857-874 (2016).
- Ketteler, R., Tooze, S. A. ATG4: More than a protease. Trends in Cell Biology. 31 (7), 515-516 (2021).
- Zhang, L., Li, J., Ouyang, L., Liu, B., Cheng, Y. Unraveling the roles of Atg4 proteases from autophagy modulation to targeted cancer therapy. Cancer Letters. 373 (1), 19-26 (2016).
- Fernández, &. #. 1. 9. 3. ;. F., López-Otín, C. The functional and pathologic relevance of autophagy proteases. The Journal of Clinical Investigation. 125 (1), 33-41 (2015).
- Maruyama, T., Noda, N. N. Autophagy-regulating protease Atg4: structure, function, regulation and inhibition. The Journal of Antibiotics. 71 (1), 72-78 (2017).
- Ketteler, R., Seed, B. Quantitation of autophagy by luciferase release assay. Autophagy. 4 (6), 801-806 (2008).
- Ketteler, R., Sun, Z., Kovacs, K. F., He, W. -. W., Seed, B. A pathway sensor for genome-wide screens of intracellular proteolytic cleavage. Genome Biology. 9 (4), 64 (2008).
- Luft, C., et al. Application of Gaussia luciferase in bicistronic and non-conventional secretion reporter constructs. BMC Biochemistry. 15, 14 (2014).
- Ketteler, R., Glaser, S., Sandra, O., Martens, U. M., Klingmüller, U. Enhanced transgene expression in primitive hematopoietic progenitor cells and embryonic stem cells efficiently transduced by optimized retroviral hybrid vectors. Gene Therapy. 9 (8), 477-487 (2002).
