Cellebasert legemiddelscreening for hemmere av autofagirelatert 4B-cysteinpeptidase
Summary
Her beskriver vi en detaljert protokoll for bruk av en luciferase-basert reporteranalyse i et halvautomatisert screeningformat med høy gjennomstrømning.
Abstract
Økende bevis har vist at høy autofagisk fluks er relatert til tumorprogresjon og kreftbehandlingsresistens. Å analysere individuelle autofagiproteiner er en forutsetning for terapeutiske strategier rettet mot denne veien. Hemming av autofagiproteasen ATG4B har vist seg å øke totaloverlevelsen, noe som tyder på at ATG4B kan være et potensielt legemiddelmål for kreftbehandling. Vårt laboratorium har utviklet en selektiv luciferasebasert analyse for overvåking av ATG4B-aktivitet i celler. For denne analysen er substratet til ATG4B, LC3B, merket ved C-terminalen med en utskillelig luciferase fra den marine hoppekrepsen Gaussia princeps (GLUC). Denne reporteren er knyttet til aktincytoskjelettet, og holder det dermed i cytoplasma av celler når det ikke kløyes. ATG4B-mediert spaltning resulterer i frigjøring av GLUC ved ikke-konvensjonell sekresjon, som deretter kan overvåkes ved å høste supernatanter fra cellekultur som et korrelat av cellulær ATG4B-aktivitet. Denne artikkelen presenterer tilpasningen av denne luciferase-baserte analysen til automatisert screening med høy gjennomstrømning. Vi beskriver arbeidsflyt og optimalisering for eksemplarisk høy gjennomstrømningsanalyse av cellulær ATG4B-aktivitet.
Introduction
Autofagi er en konservert metabolsk prosess som gjør det mulig for celler å holde intracellulær homeostase og reagere på stress ved å nedbryte gammelt, defekt eller unødvendig celleinnhold via lysosomene 1,2,3. Under noen patofysiologiske forhold fungerer denne prosessen som en avgjørende cellulær respons på nærings- og oksygenmangel, noe som resulterer i resirkulerte næringsstoffer og lipider, slik at cellene kan tilpasse seg deres metabolske behov 2,3,4. Autofagi har også blitt identifisert som en cellulær stressrespons relatert til flere sykdommer, som nevrodegenerative lidelser, patogeninfeksjon og ulike typer kreft. Autofagiens funksjon ved kreft er kompleks og avhengig av svulstens type, stadium og status. Det kan undertrykke tumorigenese gjennom autofagisk nedbrytning av skadede celler, men kan også fremme overlevelsen av avanserte svulster ved å forbedre celleoverlevelse under stressende forhold, som hypoksi, næringsmangel og cytotoksisk skade 2,4,5,6.
Flere studier har vist at autofagihemming gir en fordel som kreftstrategi. Dermed kan inhiberingen av kritiske trinn, som autofagosomdannelse eller fusjon med lysosomet, være en effektiv metode for kreftkontroll 2,4,5,6. Økende bevis har vist at ATG4B er involvert i visse patologiske forhold, og det har fått oppmerksomhet som et potensielt anticancermål 2,3,4. For eksempel ble det observert at kolorektal kreftceller og human epidermal vekstfaktorreseptor 2 (HER2)-positive brystkreftceller hadde signifikant høyere ATG4B-ekspresjonsnivåer enn tilstøtende normale celler 2,4. I prostatakreftceller resulterte hemming av ATG4B i en cellelinjespesifikk følsomhet for kjemoterapi og strålebehandling7. Nylig har det kommet sterke bevis på at bukspyttkjertelduktalt adenokarsinom (PDAC) er spesielt utsatt for ATG4B-hemming. For eksempel, i en genetisk konstruert musemodell, ble det vist at intermitterende tap av ATG4B-funksjon reduserer PDAC-tumorvekst og øker overlevelsen 3,4. Samlet sett er ATG4B sterkt overuttrykt i noen krefttyper, er relatert til utviklingen av svulst, og er knyttet til kreftbehandlingsresistens 2,4,8.
ATG4-cysteinproteasene hos pattedyr har fire familiemedlemmer, ATG4A-ATG4D. Disse proteinene utviser en viss målselektivitet mot LC3 / GABARAP (ATG8) -familien av proteiner 9,10,11 og kan ha tilleggsfunksjoner som ikke er knyttet til deres proteaseaktivitet12,13. Videre fungerer ATG4 i regulering av en ny type posttranslasjonell modifikasjon, ATG8-yleringen av proteiner11,12. Mens ATG4B og dets hovedsubstrat LC3B er de mest studerte, dukker det opp et bilde som antyder en kompleks rolle for hvert underfamiliemedlem i reguleringen av autofagiske og ikke-autofagiske prosesser. Dette bekreftes ytterligere av et komplekst nettverk av posttranslasjonelle modifikasjoner som regulerer ATG4B-aktivitet via fosforylering, acetylering, glykosylering og nitrosylering 9,10,11,12,13.
Flere kjente ATG4B-hemmere har blitt publisert 2,4,14,15. Selv om disse er egnet som forskningsverktøy, har deres farmakodynamiske profil, selektivitet eller styrke ennå utelukket dem fra utvikling som prekliniske kandidater 4,16. Samlet sett er det et presserende behov for å identifisere mer potente og selektive forbindelser. Ofte er forbindelsene gode biokjemiske hemmere av proteinfunksjon, men deres effekt i cellebaserte analyser er dårlig. Det er flere analyser for å overvåke ATG4B-aktivitet, inkludert biokjemiske metoder og cellebaserte analyser4. Vi har tidligere utviklet en enkel, luminescensbasert høykapasitetsanalyse for overvåking av ATG4B-aktivitet i celle 8,17. Denne analysen benytter et luciferaseprotein fra Gaussia princeps (GLUC) som er stabilt og aktivt i det ekstracellulære miljøet og kan induseres frigjøres fra celler som respons på ATG4B proteolytisk aktivitet18,19.
I denne reporterkonstruksjonen er dNGLUC knyttet til aktincytoskjelettet til celler. En protease-spesifikk linker kan innføres mellom β-aktinankeret og dNGLUC, noe som gjør sekresjonen avhengig av spaltning av linkeren. Vi brukte den åpne leserammen i full lengde av LC3B mellom β-aktin og dNGLUC, for å kunne overvåke LC3B-spaltning17,18,19. Selv om sekresjonsmekanismen til dNGLUC er dårlig forstått, er den spesifikk for overvåking av ATG4B-aktivitet, er ikke avhengig av generell autofagi slik den forekommer i ATG5 knockoutceller, og er mediert av ikke-konvensjonelle mekanismer som ikke krever et klassisk signalpeptid 4,18,19. Vi har med hell brukt denne reporteren til å skjerme små molekyler og siRNA-biblioteker, og har identifisert nye regulatorer av ATG4B-aktivitet, som Akt-proteinkinasene8. Dette papiret beskriver en detaljert protokoll for bruk av denne luciferase-reporteren i et halvautomatisert, høyt gjennomstrømningsscreeningsformat.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen beskriver en cellebasert reporter-genanalyse for identifisering av ATG4B-hemmere. Identifiseringen av primære treff er basert på luciferaseaktivitet ved behandling av celler som uttrykker den åpne leserammen for LC3B i full lengde mellom β-aktin og dNGLUC. Noen fordeler med denne analysen er at den er sensitiv, svært kvantitativ og ikke-invasiv, da den kan oppdage dNGLUC uten å lysere cellene. Dette papiret presenterer en detaljert protokoll for å generere en stabil cellelinje og en primær scree…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av UK Medical Research Council kjernefinansiering til MRC-UCL University Unit Grant Ref MC_U12266B, MRC Dementia Platform Grant UK MR / M02492X / 1, Pancreatic Cancer UK (tilskuddsreferanse 2018RIF_15), og UCL Therapeutic Acceleration Support-ordningen, støttet av finansiering fra MRC Confidence in Concept 2020 UCL MC / PC / 19054. Plasmidet som koder for ActinLC3dNGLUC (pMOWS-ActinLC3dNGLUC) ble hentet fra Dr. Robin Ketteler (Department of Human Medicine, Medical School Berlin).
Materials
| 50 µL Disposable Tips – Non-filtered, Pure, Nested 8 Stack (Passive Stack) | Tecan | 30038609 | Disposable 96-tip rack |
| BioTek MultiFlo | BioTek | bulk dispenser | |
| Coelenterazine | Santa Cruz Biotechnology | sc-205904 | substrate |
| Columbus Image analysis software | Perkin Elmer | Version 2.9.1 | image analysis software |
| DPBS (1x) | Gibco | 14190-144 | |
| Echo Qualified 384-Well Polypropylene Microplate, Clear, Non-sterile | Beckman Coulter | 001-14555 | 384PP plate |
| EnVision II | Perkin Elmer | luminescence plate reader | |
| Express pick Library (96-well)-L3600-Z369949-100µL | Selleckchem | L3600 | Selleckchem |
| FMK9A | MedChemExpress | HY-100522 | |
| Greiner FLUOTRAC 200 384 well plates | Greiner Bio-One | 781076 | solid-black 384-well plates |
| Harmony Imaging software | Perkin Elmer | Version 5.1 | imaging software |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate – 10 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher | H3570 | Hoechst 33342 |
| Labcyte Echo 550 series with Echo Cherry Pick software | Labcyte/Beckman Coulter | nanoscale acoustic liquid dispenser | |
| Milli-Q water | deionized water | ||
| Opera Phenix High-Content Screening System | Perkin Elmer | automated microscope | |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | |
| PhenoPlate 384-well, black, optically clear flat-bottom, tissue-culture treated, lids | Perkin Elmer | 6057300 | CellCarrier-384 Ultra PN |
| pMOWS-ActinLC3dNGLUC | Obtained from Dr. Robin Ketteler (Department of Human Medicine, Medical School Berlin) | ||
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Merck | TR-1003-G | polybrene |
| Puromycin dihydrochloride, 98%, Thermo Scientific Chemicals | ThermoFisher | J61278.ME | Puromycin |
| Tecan Freedom EVO 200 robot | Tecan | liquid handling robotic platform | |
| X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent Roche | Merck | 6366244001 | DNA transfection reagent |
Referências
- Kocaturk, N. M., et al. Autophagy as a molecular target for cancer treatment. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 134, 116-137 (2019).
- Fu, Y., et al. Targeting ATG4 in cancer therapy. Cancers. 11 (5), 649 (2019).
- Towers, C. G., Thorburn, A. Therapeutic targeting of autophagy. EBioMedicine. 14, 15-23 (2016).
- Agrotis, A., Ketteler, R. On ATG4B as drug target for treatment of solid tumours-the knowns and the unknowns. Cells. 9 (1), 53 (2019).
- Levy, J. M. M., Towers, C. G., Thorburn, A. Targeting autophagy in cancer. Nature Reviews Cancer. 17 (9), 528-542 (2017).
- Kimmelman, A. C., White, E. Autophagy and tumor metabolism. Cell Metabolism. 25 (5), 1037-1043 (2017).
- Tran, E., et al. Context-dependent role of ATG4B as target for autophagy inhibition in prostate cancer therapy. Biochemical and Biophysical Research Communications. 441 (4), 726-731 (2013).
- Pengo, N., et al. Identification of kinases and phosphatases that regulate ATG4B activity by siRNA and small molecule screening in cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 148 (2018).
- Kauffman, K. J., et al. Delipidation of mammalian Atg8-family proteins by each of the four ATG4 proteases. Autophagy. 14 (6), 992-1010 (2018).
- Tanida, I., Sou, Y. -. S., Minematsu-Ikeguchi, N., Ueno, T., Kominami, E. Atg8L/Apg8L is the fourth mammalian modifier of mammalian Atg8 conjugation mediated by human Atg4B, Atg7 and Atg3. The FEBS Journal. 273 (11), 2553-2562 (2006).
- Agrotis, A., Pengo, N., Burden, J. J., Ketteler, R. Redundancy of human ATG4 protease isoforms in autophagy and LC3/GABARAP processing revealed in cells. Autophagy. 15 (6), 976-997 (2019).
- Nguyen, T. N., et al. Atg8 family LC3/GABARAP proteins are crucial for autophagosome-lysosome fusion but not autophagosome formation during PINK1/Parkin mitophagy and starvation. The Journal of Cell Biology. 215 (6), 857-874 (2016).
- Ketteler, R., Tooze, S. A. ATG4: More than a protease. Trends in Cell Biology. 31 (7), 515-516 (2021).
- Zhang, L., Li, J., Ouyang, L., Liu, B., Cheng, Y. Unraveling the roles of Atg4 proteases from autophagy modulation to targeted cancer therapy. Cancer Letters. 373 (1), 19-26 (2016).
- Fernández, &. #. 1. 9. 3. ;. F., López-Otín, C. The functional and pathologic relevance of autophagy proteases. The Journal of Clinical Investigation. 125 (1), 33-41 (2015).
- Maruyama, T., Noda, N. N. Autophagy-regulating protease Atg4: structure, function, regulation and inhibition. The Journal of Antibiotics. 71 (1), 72-78 (2017).
- Ketteler, R., Seed, B. Quantitation of autophagy by luciferase release assay. Autophagy. 4 (6), 801-806 (2008).
- Ketteler, R., Sun, Z., Kovacs, K. F., He, W. -. W., Seed, B. A pathway sensor for genome-wide screens of intracellular proteolytic cleavage. Genome Biology. 9 (4), 64 (2008).
- Luft, C., et al. Application of Gaussia luciferase in bicistronic and non-conventional secretion reporter constructs. BMC Biochemistry. 15, 14 (2014).
- Ketteler, R., Glaser, S., Sandra, O., Martens, U. M., Klingmüller, U. Enhanced transgene expression in primitive hematopoietic progenitor cells and embryonic stem cells efficiently transduced by optimized retroviral hybrid vectors. Gene Therapy. 9 (8), 477-487 (2002).
