Ex Vivo Perfusiecultuur van grote bloedvaten in een 3D-geprinte bioreactor
Summary
Dit protocol presenteert de opzet en werking van een nieuw ontwikkelde, 3D-geprinte bioreactor voor de ex vivo kweek van bloedvaten in perfusie. Het systeem is ontworpen om gemakkelijk door andere gebruikers te worden overgenomen, praktisch, betaalbaar en aanpasbaar aan verschillende experimentele toepassingen, zoals basisbiologie en farmacologische studies.
Abstract
Vaatziekten vormen de basis van de meeste hart- en vaatziekten (HVZ), die wereldwijd de belangrijkste oorzaak van sterfte en morbiditeit blijven. Effectieve chirurgische en farmacologische ingrepen om vaatziekten te voorkomen en te behandelen zijn dringend nodig. Voor een deel beperkt het tekort aan translationele modellen het begrip van de cellulaire en moleculaire processen die betrokken zijn bij vaatziekten. Ex vivo perfusiekweekbioreactoren bieden een ideaal platform voor de studie van grote dierlijke vaten (inclusief mensen) in een gecontroleerde dynamische omgeving, waarbij het gemak van in-vitrokweek en de complexiteit van het levende weefsel worden gecombineerd. De meeste bioreactoren worden echter op maat gemaakt en zijn daarom moeilijk te gebruiken, waardoor de reproduceerbaarheid van de resultaten wordt beperkt. Dit artikel presenteert een 3D-geprint systeem dat gemakkelijk kan worden geproduceerd en toegepast in elk biologisch laboratorium, en biedt een gedetailleerd protocol voor de installatie ervan, waardoor gebruikers kunnen werken. Dit innovatieve en reproduceerbare ex vivo perfusiekweeksysteem maakt het mogelijk om bloedvaten tot 7 dagen in fysiologische omstandigheden te kweken. We verwachten dat het gebruik van een gestandaardiseerde perfusiebioreactor een beter begrip van fysiologische en pathologische processen in grote bloedvaten van dieren zal ondersteunen en de ontdekking van nieuwe therapieën zal versnellen.
Introduction
De vaatwand bevindt zich in een reactieve steady-state, die zorgt voor zowel responsiviteiten op externe stimuli (d.w.z. verandering van druk, vasoconstrictoren) als een consistent niet-activerend oppervlak dat bloedstolling en infiltratie van ontstekingscellen voorkomt. Als reactie op verouderings- en levensstijlafhankelijke stimuli en bij directe schade, activeert de vaatwand remodelleringsprocessen zoals restenose en atherosclerose, waarvan bekend is dat ze bijdragen aan veel voorkomende hart- en vaatziekten (HVZ’s), zoals ischemische beroerte en myocardinfarct. Hoewel interventionele benaderingen zoals percutane revascularisatie en stenting beschikbaar zijn om gevorderde manifestaties van vaatziekten aan te pakken, is bekend dat deze verdere vasculaire schade veroorzaken, wat vaak tot herhaling leidt. Bovendien zijn er slechts beperkte preventieve en vroegtijdige oplossingen beschikbaar. Het begrijpen van de mechanismen die de homeostase van de vaatwand in stand houden en de disfunctie ervan aansturen, vormt de kern van het ontwikkelen van nieuwe behandelingen3.
Ondanks de constante ontwikkeling en vooruitgang in de moleculaire biologie en weefselmanipulatie, blijven dierstudies een cruciaal onderdeel van vasculaire biologiestudies. In vivo dierstudies hebben enorm veel inzicht gegeven in de mechanismen van vasculaire homeostase en pathologie; Deze procedures zijn echter duur, hebben een relatief lage doorvoer en brengen aanzienlijke ethische problemen met zich mee. Bovendien zijn kleine dieren slecht representatief voor de menselijke vasculaire fysiologie, en grotere dierproeven zijn veel duurder en creëren verdere ethische overwegingen 4,5. Met de toenemende vraag naar farmaceutische en medische oplossingen voor een snel vergrijzende bevolking, worden de nadelen van diergebruik uitvergroot, wat van invloed is op de reproduceerbaarheid, betrouwbaarheid en overdraagbaarheid van resultaten naar patiëntenzorg6.
In-vitrosystemen bieden een vereenvoudigd platform om basismechanismen te bestuderen, maar slagen er niet in om de complexiteit van het hele weefsel, de interacties tussen cellen en de extracellulaire matrix en de mechanische krachten te recapituleren, die cruciale determinanten zijn bij de ontwikkeling van vaatziekten7.
Ex-vivo-onderzoeken die worden uitgevoerd op hele weefsels die in kunstmatig gecontroleerde omgevingen worden bewaard, bootsen de in vivo complexiteit na en maken onderzoeken met een relatief hoge doorvoer mogelijk8. Gezien het vermogen om de kweekomstandigheden en -omgeving nauwlettend te controleren, maken ex vivo-modellen een breed scala aan complexe studies mogelijk en bieden ze een geschikt alternatief om het gebruik van dierproeven in de vasculaire biologie te verminderen. Statische vasculaire ringculturen boden interessante inzichten, maar slaagden er niet in om het cruciale hemodynamische element9 op te nemen. De studie van het vasculaire systeem ex vivo brengt inderdaad specifieke uitdagingen met zich mee die verband houden met de vele dynamische krachten die van toepassing zijn op de cellen in de bloedvatwand. Stimuli zoals luminale stroming, turbulentie, schuifspanning, druk en wandvervorming hebben een aanzienlijke invloed op de pathofysiologie van het weefsel10,11,12.
Perfusiebioreactoren zijn essentieel voor het bestuderen van vasculaire homeostase en remodellering als reactie op letsel of hemodynamische veranderingen13. Bovendien kan perfusiecultuur worden gebruikt om de rijping en duurzaamheid van weefselgemanipuleerde bloedvaten (TEBV’s) te verbeteren, waardoor geschikte alternatieven voor vasculaire transplantaten worden geboden14.
In de handel verkrijgbare perfusiebioreactoren zijn beperkt in flexibiliteit en aanpassingsvermogen en zijn duur. Veel van de bestaande in-house ontwikkelde bioreactoren zijn in plaats daarvan moeilijk te repliceren in andere laboratoria, vanwege de beperkte beschrijvingen en het niet beschikbaar zijn van speciaal gemaakte componenten 7,8,9,10,11,12. Om deze beperkingen te overwinnen, hebben we onlangs een nieuwe bioreactor (EasyFlow) ontwikkeld, die economisch te produceren is, een reeks weefsels kan herbergen en relatief eenvoudige aanpassingen mogelijk maakt om zich aan te passen aan verschillende onderzoekseisen13. Het inzetstuk is 3D-geprint en past als in een deksel van een standaard centrifugebuisje van 50 ml. Het modulaire ontwerp en de productie van 3D-printen maken het toegankelijk en reproduceerbaar in verschillende laboratoria, en gemakkelijk aanpasbaar om aan te passen aan verschillende wetenschappelijke behoeften. Dit protocol beschrijft de assemblage en basiswerking van het bioreactorsysteem in een arteriële perfusieomgeving.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ex vivo vasculaire perfusiesystemen vormen een uniek platform om de functie en het gedrag van vasculaire cellen in hun oorspronkelijke weefsels onder gecontroleerde omstandigheden te bestuderen, wat de ontleding van complexe processen mogelijk maakt, zoals vasculaire remodellering na een verwonding22. De meeste gerapporteerde bioreactoren zijn echter in eigen huis gemaakte systemen op basis van op maat gemaakte componenten en zijn vaak moeilijk te repliceren door andere2…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen het Veterinary Pathology Centre van de University of Surrey School of Veterinary Medicine bedanken voor histologiediensten. We danken ook Drs. L. Dixon, A. Reis en M. Henstock van The Pirbright Institute (Pirbright, VK) voor hun steun bij het verkrijgen van de dierlijke weefsels, en het Department of Biochemical Sciences van de University of Surrey, in het bijzonder het technische team, voor hun voortdurende steun. RSM werd ondersteund door de Doctoral College studentship award (University of Surrey), DM en PC werden ondersteund door het National Centre for the Replacement, Refinement & Reduction of Animals in Research (subsidienummers: NC/R001006/1 en NC/T001216/1).
Materials
| EasyFlow | – | – | 3D printed by MultiJet Fusion by Protolabs |
| PA12 – 3D printing | Protolabs | – | – |
| Peristaltic pump | Heidolph | PD5201 | |
| Culture media components: | |||
| Amphotericin B solution, 250 mug/mL in deionized water | Sigma-Aldrich | A2942-20ML | |
| Dextran from Leuconostoc spp. | Sigma-Aldrich | D8802-25ML | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose, w/ 4500 mg/L glucose, L-glutamine, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | D6429-6X500ML | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | |
| Immunostaining materials: | |||
| Cryostat | LEICA | CM3050 S | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-10MG | |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023-10ML | |
| Goat α-Rabbit Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11008 | |
| Invitrogen eBioscience Fluoromount G | Thermo Fisher Scientific | 50-187-88 | |
| MX35 Premier + Microtome Blade | Thermo Scientific | 3052835 | |
| Optimal Cooling Tempearure Compound – OCT | Agar Scientific | AGR1180 | |
| Rabbit α-CD31 antibody | Abcam | ab28364 | |
| Sudan Black B | Santa Cruz Biotechnology | SC-203760 | |
| X72 SuperFrost Plus Adhesion slide, 25x75x1mm, White, 90° Ground Edges, Frosted Area 20mm, 72/box | Fisher Scientific | J1800AMNZ | |
| α-Smooth Muscle Actin (SMA) Alexa Fluor® 647-conjugated antibody | R&D Systems | IC1420R | |
| Material for laser cutting of components: | |||
| Clear Plastic Sheet, 1250 mm x 610 mm x 1 mm (for laser cutting of washers) | RS Components | 258-6590 | |
| RS PRO Translucent Rubber Sponge Sheet, 600 mm x 600 mm x 1.5 mm (for laser cutting of silicone seals) | RS Components | 840-5541 | |
| Optional pressure monitors: | |||
| Pressure sensor | Parker Hannifin | 080-699PSX-3P-5 | |
| SciPres Pressure Monitor | Parker Hannifin | 206-200-M | |
| Pre-sterilized single use plasticware: | |||
| 0.2 um filter | Sarstedt | 70.1114.210 | |
| 20 mL Sterile syringe | IMS Euro | 40004 | |
| 50 mL Centrifuge Tube | Thermo Fisher Scientific | Sarstedt – 62.547.254 | |
| Small components: | |||
| Cable ties | – | – | |
| Masterflex Adapter Fittings, Female Luer to Hose Barb | Cole-Parmer | WZ-30800-10 | Barb Adaptor |
| Masterflex Polycarbonate Luer Fittings | Cole-Parmer | AU-45504-84 | |
| Nylon Miniature Check Valve | Cole-Parmer | 98553-00 | |
| RS PRO Translucent Rubber Sponge Sheet, 600 mm x 600 mm x 1.5 mm (for laser cutting of silicone seals) | RS Components | 840-5541 | |
| Stainless Steel M2 Hex Nuts | RS Components | 527-218 | |
| Stainless Steel M2 x 6 mm Screws | RS Components | 418-7426 | |
| Stainless Steel M5 Hex Nuts | RS Components | 189-585 | |
| Surgical vessel loop | Vascular Silicone Ties,International Medical Supplies | 10-1003 | |
| Three-way valves | IMS Euro | 91000 | |
| Surgical Equipment | |||
| Anatomical Forceps, GRAEFE, Curved, 10 cm SKU: BD-07 | International Medical Supplies | SKU: BD-07 | |
| Micro Forceps, Angled, 0.3 mm, 11 cm | International Medical Supplies | SKU: BD-361 | |
| Micro Scissors Noyes, Curved, 12 cm | International Medical Supplies | SKU: FD-12 | |
| Troge Surgical Scalpels – Size 23 – Box of 100 | International Medical Supplies | 63114 | |
| Tubing: | |||
| Eppendorf silicone tubing (I.D.1.6 mm, O.D.4.7 mm) | Eppendorf | M0740-2396 | System tubing |
| Masterflex PharMed BPT 3-Stop Tubing | ISMATEC | 95714-48 | Soft wall tubing (for clamp) |
| RS PRO Transparent Hose Pipe, 0.8 mm ID, Silicone | RS Components | 667-8432 | Resistance tubing (small inner diameter) |
| Tygon for food (I.D. 4.8 mm, W.T. 1.6 mm) | Heidolph | 525-30027-00-0 | One way valve tube |
| Verderflex Yellow Hose Pipe, 6.4 mm ID, Verderprene | RS Components | 125-4042 | Pump Tubing |
Referências
- Davies, P. F., Civelek, M., Fang, Y., Fleming, I. The atherosusceptible endothelium: Endothelial phenotypes in complex haemodynamic shear stress regions in vivo. Cardiovascular Research. 99 (2), 315-327 (2013).
- Gugliandolo, E., et al. Palmitoylethanolamide and Polydatin combination reduces inflammation and oxidative stress in vascular injury. Pharmacological Research. 123, 83-92 (2017).
- Anselmino, M., et al. Catheter ablation of atrial fibrillation in patients with left ventricular systolic dysfunction: A systematic review and meta-analysis. Circulation, Arrhythmia, and Electrophysiology. 7 (6), 1011-1018 (2014).
- Viola, M., et al. Subcutaneous delivery of monoclonal antibodies: How do we get there. Journal of Controlled Release. 286, 301-314 (2018).
- Kim, D. D. In vitro cellular models for nasal drug absorption studies. Drug Absorption Studies: In Situ, In Vitro and In Silico Models. , 216-234 (2008).
- Lewis, D. I. Animal experimentation: Implementation and application of the 3Rs. Emerging Topics in Life Sciences. 3 (6), 675-679 (2019).
- Rouwkema, J., et al. In vitro platforms for tissue engineering: Implications for basic research and clinical translation. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 5 (8), e164-167 (2011).
- Xu, Y., Shrestha, N., Préat, V., Beloqui, A. An overview of in vitro, ex vivo and in vivo models for studying the transport of drugs across intestinal barriers. Advanced Drug Delivery Reviews. 175, 113795 (2021).
- Vaghela, R., et al. Vessel grafts for tissue engineering revisited-Vessel segments show location-specific vascularization patterns in ex vivo ring assay. Microcirculation. 29 (2), e12742 (2022).
- Håkansson, J., et al. Individualized tissue-engineered veins as vascular grafts: A proof of concept study in pig. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 15 (10), 818-830 (2021).
- Saucy, F., et al. Ex vivo pulsatile perfusion of human saphenous veins induces intimal hyperplasia and increased levels of the plasminogen activator inhibitor 1. European Surgical Research. 45 (1), 50-59 (2010).
- Tosun, Z., McFetridge, P. S. Variation in cardiac pulse frequencies modulates vSMC phenotype switching during vascular remodeling. Cardiovascular Engineering and Technology. 6 (1), 59-70 (2015).
- Matos, R. S., Maselli, D., McVey, J. H., Heiss, C., Campagnolo, P. 3D printed bioreactor enabling the pulsatile culture of native and angioplastied large arteries. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 9, 864580 (2022).
- Neff, L. P., et al. Vascular smooth muscle enhances functionality of tissue-engineered blood vessels in vivo. Journal of Vascular Surgery. 53 (2), 426-434 (2011).
- Boparai, K. S., Singh, R. Advances in Fused Deposition Modeling. In: Module. Refrence in Materials Science and Materials Engineering. , (2017).
- McKeen, L. W., McKeen, L. W. Chapter 6 – Polyamides (Nylons). The Effect of Creep and Other Time Related Factors on Plastics and Elastomers (Second Edition). , 197-262 (2012).
- Moradi, M., Mehrabi, O., Azdast, T., Benyounis, K. Y. Enhancement of low power CO2 laser cutting process for injection molded polycarbonate). Optics & Laser Technology. 96, 208-218 (2017).
- Ghasem, N. . Computer Methods in Chemical Engineering. , (2021).
- Lying, F., Gazi, F., Gardner, E. Preparation of tissues and cells for infrared and raman spectroscopy and imaging. Biomedical Applications of Synchrotron Infrared Microspectroscopy.RSC Analytical Spectroscopy Monographs. (11), 147-185 (2011).
- Sassi, L., et al. A perfusion bioreactor for longitudinal monitoring of bioengineered liver constructs. Nanomaterials. 11 (2), 275 (2021).
- Haykal, S., et al. Double-chamber rotating bioreactor for dynamic perfusion cell seeding of large-segment tracheal allografts: Comparison to conventional static methods. Tissue Engineering. Part C, Methods. 20 (8), 681-692 (2014).
- Kural, M. H., Dai, G., Niklason, L. E., Gui, L. An ex vivo vessel injury model to study remodeling. Cell Transplant. 27 (9), 1375-1389 (2018).
- Wong, M. M., Hong, X., Karamariti, E., Hu, Y., Xu, Q. Generation and grafting of tissue-engineered vessels in a mouse model. Journal of Visualized Experiments. (97), 52565 (2015).
- Alvino, V. V., et al. In vitro and in vivo preclinical testing of pericyte-engineered grafts for the correction of congenital heart defects. Journal of the American Heart Association. 9 (4), e014214 (2020).
- Nerurkar, N. L., Sen, S., Baker, B. M., Elliott, D. M., Mauck, R. L. Dynamic culture enhances stem cell infiltration and modulates extracellular matrix production on aligned electrospun nanofibrous scaffolds. Acta Biomaterialia. 7 (2), 485-491 (2011).
- Engebretson, B., Mussett, Z. R., Sikavitsas, V. I. The effects of varying frequency and duration of mechanical stimulation on a tissue-engineered tendon construct. Connective Tissue Research. 59 (2), 167-177 (2018).
- Saunders, S. K., et al. Evaluation of perfusion-driven cell seeding of small diameter engineered tissue vascular grafts with a custom-designed seed-and-culture bioreactor. PLoS One. 17 (6), e0269499 (2022).
- Stephenson, M., Grayson, W. Recent advances in bioreactors for cell-based therapies. F1000Research. 7, (2018).
