Ex Vivo Cultura de Perfusão de Grandes Vasos Sanguíneos em Biorreator Impresso em 3D
Summary
Este protocolo apresenta a instalação e operação de um biorreator impresso em 3D recentemente desenvolvido para a cultura ex vivo de vasos sanguíneos em perfusão. O sistema foi projetado para ser facilmente adotado por outros usuários, prático, acessível e adaptável a diferentes aplicações experimentais, como biologia básica e estudos farmacológicos.
Abstract
A doença vascular constitui a base da maioria das doenças cardiovasculares (DCV), que continuam sendo a principal causa de mortalidade e morbidade em todo o mundo. Intervenções cirúrgicas e farmacológicas eficazes para prevenir e tratar a doença vascular são urgentemente necessárias. Em parte, a escassez de modelos translacionais limita a compreensão dos processos celulares e moleculares envolvidos na doença vascular. Biorreatores de cultura de perfusão ex vivo fornecem uma plataforma ideal para o estudo de grandes vasos animais (incluindo humanos) em um ambiente dinâmico controlado, combinando a facilidade de cultivo in vitro e a complexidade do tecido vivo. A maioria dos biorreatores é, no entanto, de fabricação personalizada e, portanto, de difícil adoção, limitando a reprodutibilidade dos resultados. Este trabalho apresenta um sistema impresso em 3D que pode ser facilmente produzido e aplicado em qualquer laboratório biológico, e fornece um protocolo detalhado para sua configuração, possibilitando a operação dos usuários. Este inovador e reprodutível sistema de cultura de perfusão ex vivo permite o cultivo de vasos sanguíneos por até 7 dias em condições fisiológicas. Esperamos que a adoção de um biorreator de perfusão padronizado possa apoiar uma melhor compreensão dos processos fisiológicos e patológicos em grandes vasos sanguíneos de animais e acelerar a descoberta de novas terapêuticas.
Introduction
A parede vascular existe em estado estacionário reativo, o que garante tanto responsividade a estímulos externos (i.e., mudança de pressão, vasoconstritores) quanto uma superfície consistente e não ativadora, impedindo a coagulação sanguínea e a infiltração de células inflamatórias1. Em resposta a estímulos dependentes do envelhecimento e do estilo de vida e mediante dano direto, a parede vascular ativa processos de remodelação como reestenose e aterosclerose, que são conhecidos contribuintes para doenças cardiovasculares (DCV) comuns, como acidente vascular cerebral isquêmico e infarto do miocárdio2. Embora abordagens intervencionistas, como revascularização percutânea e implante de stent, estejam disponíveis para combater manifestações avançadas de doença vascular, elas são conhecidas por provocar mais danos vasculares, muitas vezes levando à recorrência. Além disso, apenas estão disponíveis soluções preventivas e em fase inicial limitadas. A compreensão dos mecanismos que mantêm a homeostase da parede vascular e impulsionam sua disfunção está no cerne do desenvolvimento de novas curas3.
Apesar do constante desenvolvimento e avanços na biologia molecular e engenharia de tecidos, os estudos em animais continuam sendo um componente crucial dos estudos de biologia vascular. Estudos in vivo em animais têm fornecido enorme insight sobre os mecanismos da homeostase e patologia vascular; no entanto, esses procedimentos são caros, têm rendimento relativamente baixo e apresentam problemas éticos substanciais. Além disso, animais de pequeno porte são pouco representativos da fisiologia vascular humana, e experimentos com animais maiores são muito mais caros e criam considerações éticas adicionais 4,5. Com a crescente demanda por soluções farmacêuticas e médicas para uma população em rápido envelhecimento, as desvantagens do uso de animais são ampliadas, impactando a reprodutibilidade, confiabilidade e transferibilidade dos resultados para o cuidado do paciente6.
Os sistemas in vitro oferecem uma plataforma simplificada para o estudo de mecanismos básicos, mas não conseguem recapitular a complexidade de todo o tecido, as interações entre as células e a matriz extracelular e as forças mecânicas, que são determinantes críticos no desenvolvimento de doenças vasculares7.
Estudos ex vivo realizados em tecidos inteiros mantidos em ambientes artificialmente controlados mimetizam a complexidade in vivo, ao mesmo tempo em que permitem investigações de rendimento relativamente alto8. Dada a capacidade de controlar de perto as condições de cultivo e o ambiente, os modelos ex vivo permitem uma ampla gama de estudos complexos e fornecem uma alternativa adequada para reduzir o uso de procedimentos animais em biologia vascular. As culturas estáticas dos anéis vasculares ofereceram informações interessantes, mas falharam em incorporar o elemento hemodinâmico crucial9. De fato, o estudo do sistema vascular ex vivo apresenta desafios específicos relacionados às muitas forças dinâmicas que se aplicam às células dentro da parede dos vasos sanguíneos. Estímulos como fluxo luminal, turbulência, tensão de cisalhamento, pressão e deformação da parede afetam significativamente a fisiopatologia tecidual10,11,12.
Os biorreatores de perfusão são essenciais para o estudo da homeostase e remodelamento vascular em resposta a lesões ou alterações hemodinâmicas13. Além disso, a cultura de perfusão pode ser utilizada para melhorar a maturação e a durabilidade dos vasos sanguíneos manipulados por tecidos (TEBVs), fornecendo alternativas adequadas para enxertos vasculares14.
Os biorreatores de perfusão comercialmente disponíveis são limitados em flexibilidade e adaptabilidade e são dispendiosos. Muitos dos biorreatores desenvolvidos internamente são difíceis de replicar em outros laboratórios, devido às descrições limitadas e à indisponibilidade de componentes especialmente fabricados 7,8,9,10,11,12. Para superar essas limitações, desenvolvemos recentemente um novo biorreator (EasyFlow), que é econômico de produzir, acomoda uma variedade de tecidos e permite modificações relativamente simples para se adaptar a diferentes demandas de pesquisa13. A pastilha é impressa em 3D e se encaixa como em uma tampa de um tubo de centrífuga padrão de 50 mL. Seu design modular e fabricação de impressão 3D o tornam acessível e reprodutível em diferentes laboratórios, bem como facilmente modificável para se adaptar a diferentes necessidades científicas. Este protocolo descreve a montagem e operação básica do sistema de biorreator em ambiente de perfusão arterial.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os sistemas de perfusão vascular ex vivo constituem uma plataforma única para estudar a função e o comportamento das células vasculares dentro de seus tecidos nativos sob condições controladas, o que possibilita a dissecção de processos complexos como o remodelamento vascular pós-lesão22. No entanto, a maioria dos biorreatores relatados são sistemas fabricados internamente baseados em componentes feitos sob medida e muitas vezes são difíceis de replicar por outros<sup class=…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem ao Centro de Patologia Veterinária da Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade de Surrey pelos serviços de histologia. Também agradecemos aos Drs. L. Dixon, A. Reis e M. Henstock do The Pirbright Institute (Pirbright, Reino Unido) por seu apoio na aquisição dos tecidos animais, e ao Departamento de Ciências Bioquímicas da Universidade de Surrey, especialmente à equipe técnica, por seu apoio contínuo. O RSM foi apoiado pelo prêmio de estudante do Doctoral College (University of Surrey), DM e PC foram apoiados pelo National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research (números de bolsa: NC/R001006/1 e NC/T001216/1).
Materials
| EasyFlow | – | – | 3D printed by MultiJet Fusion by Protolabs |
| PA12 – 3D printing | Protolabs | – | – |
| Peristaltic pump | Heidolph | PD5201 | |
| Culture media components: | |||
| Amphotericin B solution, 250 mug/mL in deionized water | Sigma-Aldrich | A2942-20ML | |
| Dextran from Leuconostoc spp. | Sigma-Aldrich | D8802-25ML | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose, w/ 4500 mg/L glucose, L-glutamine, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | D6429-6X500ML | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | |
| Immunostaining materials: | |||
| Cryostat | LEICA | CM3050 S | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-10MG | |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023-10ML | |
| Goat α-Rabbit Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11008 | |
| Invitrogen eBioscience Fluoromount G | Thermo Fisher Scientific | 50-187-88 | |
| MX35 Premier + Microtome Blade | Thermo Scientific | 3052835 | |
| Optimal Cooling Tempearure Compound – OCT | Agar Scientific | AGR1180 | |
| Rabbit α-CD31 antibody | Abcam | ab28364 | |
| Sudan Black B | Santa Cruz Biotechnology | SC-203760 | |
| X72 SuperFrost Plus Adhesion slide, 25x75x1mm, White, 90° Ground Edges, Frosted Area 20mm, 72/box | Fisher Scientific | J1800AMNZ | |
| α-Smooth Muscle Actin (SMA) Alexa Fluor® 647-conjugated antibody | R&D Systems | IC1420R | |
| Material for laser cutting of components: | |||
| Clear Plastic Sheet, 1250 mm x 610 mm x 1 mm (for laser cutting of washers) | RS Components | 258-6590 | |
| RS PRO Translucent Rubber Sponge Sheet, 600 mm x 600 mm x 1.5 mm (for laser cutting of silicone seals) | RS Components | 840-5541 | |
| Optional pressure monitors: | |||
| Pressure sensor | Parker Hannifin | 080-699PSX-3P-5 | |
| SciPres Pressure Monitor | Parker Hannifin | 206-200-M | |
| Pre-sterilized single use plasticware: | |||
| 0.2 um filter | Sarstedt | 70.1114.210 | |
| 20 mL Sterile syringe | IMS Euro | 40004 | |
| 50 mL Centrifuge Tube | Thermo Fisher Scientific | Sarstedt – 62.547.254 | |
| Small components: | |||
| Cable ties | – | – | |
| Masterflex Adapter Fittings, Female Luer to Hose Barb | Cole-Parmer | WZ-30800-10 | Barb Adaptor |
| Masterflex Polycarbonate Luer Fittings | Cole-Parmer | AU-45504-84 | |
| Nylon Miniature Check Valve | Cole-Parmer | 98553-00 | |
| RS PRO Translucent Rubber Sponge Sheet, 600 mm x 600 mm x 1.5 mm (for laser cutting of silicone seals) | RS Components | 840-5541 | |
| Stainless Steel M2 Hex Nuts | RS Components | 527-218 | |
| Stainless Steel M2 x 6 mm Screws | RS Components | 418-7426 | |
| Stainless Steel M5 Hex Nuts | RS Components | 189-585 | |
| Surgical vessel loop | Vascular Silicone Ties,International Medical Supplies | 10-1003 | |
| Three-way valves | IMS Euro | 91000 | |
| Surgical Equipment | |||
| Anatomical Forceps, GRAEFE, Curved, 10 cm SKU: BD-07 | International Medical Supplies | SKU: BD-07 | |
| Micro Forceps, Angled, 0.3 mm, 11 cm | International Medical Supplies | SKU: BD-361 | |
| Micro Scissors Noyes, Curved, 12 cm | International Medical Supplies | SKU: FD-12 | |
| Troge Surgical Scalpels – Size 23 – Box of 100 | International Medical Supplies | 63114 | |
| Tubing: | |||
| Eppendorf silicone tubing (I.D.1.6 mm, O.D.4.7 mm) | Eppendorf | M0740-2396 | System tubing |
| Masterflex PharMed BPT 3-Stop Tubing | ISMATEC | 95714-48 | Soft wall tubing (for clamp) |
| RS PRO Transparent Hose Pipe, 0.8 mm ID, Silicone | RS Components | 667-8432 | Resistance tubing (small inner diameter) |
| Tygon for food (I.D. 4.8 mm, W.T. 1.6 mm) | Heidolph | 525-30027-00-0 | One way valve tube |
| Verderflex Yellow Hose Pipe, 6.4 mm ID, Verderprene | RS Components | 125-4042 | Pump Tubing |
Referências
- Davies, P. F., Civelek, M., Fang, Y., Fleming, I. The atherosusceptible endothelium: Endothelial phenotypes in complex haemodynamic shear stress regions in vivo. Cardiovascular Research. 99 (2), 315-327 (2013).
- Gugliandolo, E., et al. Palmitoylethanolamide and Polydatin combination reduces inflammation and oxidative stress in vascular injury. Pharmacological Research. 123, 83-92 (2017).
- Anselmino, M., et al. Catheter ablation of atrial fibrillation in patients with left ventricular systolic dysfunction: A systematic review and meta-analysis. Circulation, Arrhythmia, and Electrophysiology. 7 (6), 1011-1018 (2014).
- Viola, M., et al. Subcutaneous delivery of monoclonal antibodies: How do we get there. Journal of Controlled Release. 286, 301-314 (2018).
- Kim, D. D. In vitro cellular models for nasal drug absorption studies. Drug Absorption Studies: In Situ, In Vitro and In Silico Models. , 216-234 (2008).
- Lewis, D. I. Animal experimentation: Implementation and application of the 3Rs. Emerging Topics in Life Sciences. 3 (6), 675-679 (2019).
- Rouwkema, J., et al. In vitro platforms for tissue engineering: Implications for basic research and clinical translation. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 5 (8), e164-167 (2011).
- Xu, Y., Shrestha, N., Préat, V., Beloqui, A. An overview of in vitro, ex vivo and in vivo models for studying the transport of drugs across intestinal barriers. Advanced Drug Delivery Reviews. 175, 113795 (2021).
- Vaghela, R., et al. Vessel grafts for tissue engineering revisited-Vessel segments show location-specific vascularization patterns in ex vivo ring assay. Microcirculation. 29 (2), e12742 (2022).
- Håkansson, J., et al. Individualized tissue-engineered veins as vascular grafts: A proof of concept study in pig. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 15 (10), 818-830 (2021).
- Saucy, F., et al. Ex vivo pulsatile perfusion of human saphenous veins induces intimal hyperplasia and increased levels of the plasminogen activator inhibitor 1. European Surgical Research. 45 (1), 50-59 (2010).
- Tosun, Z., McFetridge, P. S. Variation in cardiac pulse frequencies modulates vSMC phenotype switching during vascular remodeling. Cardiovascular Engineering and Technology. 6 (1), 59-70 (2015).
- Matos, R. S., Maselli, D., McVey, J. H., Heiss, C., Campagnolo, P. 3D printed bioreactor enabling the pulsatile culture of native and angioplastied large arteries. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 9, 864580 (2022).
- Neff, L. P., et al. Vascular smooth muscle enhances functionality of tissue-engineered blood vessels in vivo. Journal of Vascular Surgery. 53 (2), 426-434 (2011).
- Boparai, K. S., Singh, R. Advances in Fused Deposition Modeling. In: Module. Refrence in Materials Science and Materials Engineering. , (2017).
- McKeen, L. W., McKeen, L. W. Chapter 6 – Polyamides (Nylons). The Effect of Creep and Other Time Related Factors on Plastics and Elastomers (Second Edition). , 197-262 (2012).
- Moradi, M., Mehrabi, O., Azdast, T., Benyounis, K. Y. Enhancement of low power CO2 laser cutting process for injection molded polycarbonate). Optics & Laser Technology. 96, 208-218 (2017).
- Ghasem, N. . Computer Methods in Chemical Engineering. , (2021).
- Lying, F., Gazi, F., Gardner, E. Preparation of tissues and cells for infrared and raman spectroscopy and imaging. Biomedical Applications of Synchrotron Infrared Microspectroscopy.RSC Analytical Spectroscopy Monographs. (11), 147-185 (2011).
- Sassi, L., et al. A perfusion bioreactor for longitudinal monitoring of bioengineered liver constructs. Nanomaterials. 11 (2), 275 (2021).
- Haykal, S., et al. Double-chamber rotating bioreactor for dynamic perfusion cell seeding of large-segment tracheal allografts: Comparison to conventional static methods. Tissue Engineering. Part C, Methods. 20 (8), 681-692 (2014).
- Kural, M. H., Dai, G., Niklason, L. E., Gui, L. An ex vivo vessel injury model to study remodeling. Cell Transplant. 27 (9), 1375-1389 (2018).
- Wong, M. M., Hong, X., Karamariti, E., Hu, Y., Xu, Q. Generation and grafting of tissue-engineered vessels in a mouse model. Journal of Visualized Experiments. (97), 52565 (2015).
- Alvino, V. V., et al. In vitro and in vivo preclinical testing of pericyte-engineered grafts for the correction of congenital heart defects. Journal of the American Heart Association. 9 (4), e014214 (2020).
- Nerurkar, N. L., Sen, S., Baker, B. M., Elliott, D. M., Mauck, R. L. Dynamic culture enhances stem cell infiltration and modulates extracellular matrix production on aligned electrospun nanofibrous scaffolds. Acta Biomaterialia. 7 (2), 485-491 (2011).
- Engebretson, B., Mussett, Z. R., Sikavitsas, V. I. The effects of varying frequency and duration of mechanical stimulation on a tissue-engineered tendon construct. Connective Tissue Research. 59 (2), 167-177 (2018).
- Saunders, S. K., et al. Evaluation of perfusion-driven cell seeding of small diameter engineered tissue vascular grafts with a custom-designed seed-and-culture bioreactor. PLoS One. 17 (6), e0269499 (2022).
- Stephenson, M., Grayson, W. Recent advances in bioreactors for cell-based therapies. F1000Research. 7, (2018).
