1. Eksperimentel forberedelse BEMÆRK: Detaljerne om alle de reagenser/udstyr, der er nævnt i dette trin, er angivet i materialetabellen. Få rekombinant human PD-1 (rhPD-1; polyhistidin-mærket). Rekonstituér frysetørret rhPD1 med sterilfiltreret fosfatbufret saltvand (PBS), pH 7,4, før brug. Der opnås biotinyleret rekombinant human PD-L1 (rhPD-L1). Rekonstituér frysetørret rhPD-L1 med sterilt deioniseret vand før brug. Få streptavidin-konjugeret R-phycoerythrindetektionsreagens (SAPE). Opbevar alle SAPE-opløsninger, der er beskyttet mod lys ved køleskabstemperaturer (dvs. 2-8 °C). Få fluorescerende farvede magnetiske mikrosfærer (6,5 μm diameter, polystyren med indlejret magnetit) og perlekoblingssættet15 (hvis brugt, se materialetabellen). Kovalent kobling til mikrosfærerne kræver sulfo-NHS (sulfo-N-hydrosuccinimid) og EDC (N-[3-dimethylaminopropyl]-N′-ethylcarbodiimidhydrochlorid).BEMÆRK: Magnetiske perlesæt fås med et hvilket som helst af 500 unikke fluorescerende tags, hvilket giver mulighed for identifikation og differentiering fra forskellige perlesæt16. Perler tilbydes i lagerkoncentrationer på 2,5 × 106 perler/ml og 12,5 × 106 perler/ml. Opbevar perlerne beskyttet mod lys ved køleskabstemperaturer (dvs. 2-8 °C). Frys ikke perleophængene. Få positive og negative kontrolantistoffer og Brilliant Violet 421 (BV421)-mærkede sekundære detektionsantistoffer. Opbevar alle fluorescerende konjugerede molekyler, der er beskyttet mod lys. Udfør alle koblingsreaktioner i lavproteinbindingsrør og alle analysereaktioner i lavproteinbindings-, rundbundede, 96-brønds mikrotiterplader. Forsegl pladerne med engangsklæbefolie eller plastdæksler med 96 brønde mikroplader til analyseinkubationstrinnene. Brug en magnetisk pladeseparator til at immobilisere perlerne under analysevasketrinnene.BEMÆRK: Flowanalysesystemet med dobbelt reporter har tre lasere: (1) en, der identificerer og kvantificerer den perlesætspecifikke fluorescens (klassificeringskanal); (2) en, der detekterer og kvantificerer den målspecifikke phycoerythrin (PE) fluorescens (Reporter Channel 1; 532 nm excitation, “orange” 565-585 nm emission); og (3) en, der detekterer og kvantificerer den målspecifikke BV421-fluorescens af en anden målanalysand (Reporter Channel 2; 405 nm excitation, “blå” 421-441 nm emission). 2. Kobling af rhPD-1 til magnetiske perler BEMÆRK: Det protein, der skal kobles, skal være fri for bovin serumalbumin (BSA), natriumazid, glycin, glycerol, tris(hydroxymethyl)aminomethan (Tris) eller aminholdige additiver og skal suspenderes i PBS ved pH 7,4. Der findes et kommercielt koblingssæt, der indeholder alle de nødvendige reagenser og buffere, der er beskrevet heri (se materialetabellen). Alle koblingsreagenserne tages ud af køleskabet, og lad dem ekvilibrere til stuetemperatur (RT, 18-22 °C) i 20-30 min. Resuspender stammikrosfærerne ved kortvarigt at hvirvelstrømme, sonicere eller rotere (15 min ved 15-30 o / min) i henhold til produktdatabladet. Overfør 1 × 106 magnetiske perler til et 1,5 ml lavproteinbindende mikrocentrifugerør (se materialetabellen). Vask perler med 100 μL aktiveringsbuffer15: 0,1 MNaH2PO4 (monobasisk), pH 6,2.BEMÆRK: Kobling kan også udføres ved hjælp af et forudkonfigureret koblingssæt, som indeholder 0,1 M 2-morpholinoethansulfonsyre (MES), pH 6,0, som en alternativ aktiverings- og koblingsbuffer (se materialetabellen).Anbring røret med perlerne i en magnetisk separator i 1-2 min.BEMÆRK: Alternativt kan perlerne adskilles ved mikrocentrifugering ved ≥8.000 × g i 1-2 min. Supernatanten suges til med en pipette fra de magnetimmobiliserede eller pelleterede perler, mens røret stadig er placeret i magnetseparatoren. Fjern mikrocentrifugerøret fra magneten, og tilsæt 80 μL koblingsbuffer (se materialetabellen). Vortex reaktionsrøret forsigtigt og sonikere i 20 s for at sprede perlerne. Aktivér perlerne med sulfo-NHS og EDC.BEMÆRK: Stamopløsningen af sulfo-NHS er 50 mg/ml opløst i aktiveringsbuffer. Stamopløsningen af EDC er også 50 mg/ml opløst i aktiveringsbuffer. Både aktiveringsbufferen og fugtigheden i atmosfæren forårsager EDC-nedbrydning. Det anbefales ikke at bruge opbevaret EDC-opløsning. Lav lige nok frisk EDC-opløsning før trinnet, og brug den straks, når opløsningen er klar. Kassér overskydende EDC-opløsning.FORSIGTIG: EDC forårsager alvorlig øjenirritation og er irriterende for luftvejene og huden.Tilsæt 10 μL sulfo-NHS til mikrofugerøret, der indeholder de vaskede og aktiverede perler. Tilsæt 10 μL EDC-stamopløsning til mikrofugerøret, der indeholder perlerne og sulfo-NHS. Beskyt de lysfølsomme mikrosfærer mod lys, og drej på rotatoren i 20 minutter ved 15-30 o / min ved RT (18-22 °C). Alternativt kan røret forblive stationært under aktiveringstrinnet, hvis det forsigtigt hvirvles for at omfordele perlerne med 10 minutters mellemrum. Vask overskydende koblingsreagenser af perlerne.Anbring røret med de aktiverede perler i en magnetisk separator i 1-2 min. Supernatanten suges til med en pipette fra magnetimmobiliserede eller pelleterede perler, mens røret stadig er placeret i magnetseparatoren. Fjern mikrocentrifugerøret fra magneten, og tilsæt 100 μL aktiveringsbuffer. Vortex reaktionsrøret forsigtigt for at sprede perlerne. Gentag trin 2.6.1-2.6.4 yderligere to gange for i alt tre vaske. Efter vask ophænges perlerne i 100 μL aktiveringsbuffer i en koncentration på ca. 10 × 106 perler/ml. Par rhPD-1-peptidet til de aktiverede perler.Tilsæt 390 μL aktiveringsbuffer til røret, der indeholder de aktiverede perler, for at bringe det samlede perleophængsvolumen op på 490 μL. Der tilsættes 1 μg PD-1-peptid til den aktiverede perlesuspension ved at tilsætte 10 μL PD-1-peptidopløsning (1 mg/ml opløst i PBS) til røret indeholdende de aktiverede perler. Kort hvirvel mikrocentrifugerøret for ensartet fordeling af PD-1 og aktiverede perler. Perlerne inkuberes med PD-1 i 2 timer i mørke ved RT (18-22 °C) med rotation (15-30 omdr./min.). Vask perlerne to gange (2x) med Assay/Wash Buffer (PBS-TBN: 1x PBS, pH 7,4 + 0,1% BSA + 0,05% Tween-20 + 0,05% NaN315).Anbring røret med de aktiverede perler i en magnetisk separator i 1-2 min. Supernatanten suges til med en pipette fra de magnetimmobiliserede eller pelleterede perler, mens røret stadig er placeret i magnetseparatoren. Fjern mikrocentrifugerøret fra magneten, og tilsæt 100 μL aktiveringsbuffer. Vortex reaktionsrøret forsigtigt for at sprede perlerne. Gentag trin 2.8.1-2.8.4 en ekstra gang for i alt to vaske. Efter vask suspenderes perlerne i 100 μL aktiveringsbuffer i en koncentration på 10 × 106 perler/ml.BEMÆRK: Assay/Wash-bufferen kan fremstilles uden natriumazid (konserveringsmiddel), hvis bufferen ikke også anvendes som lagringsmedium. Opbevar rhPD-1-koblede perler i mørke i køleskabet ved 2-8 °C, hvis de ikke anvendes straks. Proteinkoblede perler er stabile i op til 18 måneder. 3. Evaluering af vellykket rhPD-1-kobling til perlerne BEMÆRK: De rhPD-1-koblede mikrosfærer omsættes med biotinyleret rhPD-L1, hvoraf sidstnævnte detekteres ved inkubation med SAPE efterfulgt af en vurdering af flowcytometeret. Dette verificerer både vellykket PD-1-kobling til magnetperlerne og også funktionel interaktion mellem rhPD-1- og rhPD-L1-proteinerne. Opret en dobbelt seriel fortyndingsserie af biotinyleret rhPD-L1 i PBS-TBN (stamopløsningen rhPD-L1 er 1 mg/ml). Det endelige rhPD-L1-koncentrationsområde, der skal testes, er en 8 μg/ml opløsning ned til en 313 pg/ml opløsning. Der oprettes 150 μL volumener af hver rhPD-L1-fortynding: 50 μL for hver reaktion og to reaktioner pr. tilstand plus tilstrækkelig overskridelse til at rumme pipetteringstab.Mærk rhPD-L1 fortyndingsmikrofugerørene som 8 μg/ml, 4 μg/ml, 2 μg/ml, 1 μg/ml, 0,5 μg/ml, 0,25 μg/ml, 0,125 μg/ml, 0,063 μg/ml og 0,031 μg/ml. Et 0 μg/ml rør (kun PBS-TBN) fungerer som no-PD-L1-styring. Forindlæs 150 μL PBS-TBN til alle de mærkede rhPD-L1 fortyndingsrør.BEMÆRK: Den højeste endelige rhPD-L1-koncentration, der skal testes, er 8 μg / ml, og rhPD-L1 fortyndes 1: 1 ved tilsætning til reaktionsblandingen, så fortyndingsrøret mærket “8 μg / ml” henviser til den endelige koncentration og indeholder faktisk 16 μg / ml rhPD-L1. Etiketterne på alle fortyndingsrørene angiver den endelige rhPD-L1-koncentration efter tilsætning til reaktionen. Opret den højeste koncentration rhPD-L1-fortynding (16 μg/ml faktisk). Dette er en totrins, 62,5 gange fortynding af 1 mg/ml rhPD-L1 stamopløsning (1.000 μg/16 μg = 62,5).Der kombineres 84 μL PBS-TBN med 16 μL rhPD-L1 stamopløsning (1 mg/ml, dvs. 1.000 μL) i et mikrocentrifugeglas. Dette er en 6,25 gange fortynding, og den resulterende koncentration er 160 μg/ml rhPD-L1. I røret mærket “8 μg / ml” kombineres 270 μL PBS-TBN med 30 μL af rhPD-L1-fortyndingen oprettet i det foregående trin (160 μg / ml). Dette er en 10 gange fortynding, og den resulterende koncentration er faktisk 16 μg / ml. Røretiketten “8 μg/ml” henviser til dens endelige koncentration efter tilsætning af reaktionen. 150 μL af rhPD-L1-fortyndingen skabt i trin 3.1.3 (“8 μg/ml”) overføres til “4 μg/ml”-røret, mikrocentrifugerørhætten lukkes og hvirvles kortvarigt for at blande opløsningen. Gentag trin 3.1.4 sekventielt, indtil rhPD-L1-fortyndingsserien er afsluttet. Efter fremstillingen skal alle rør mellem “8 μg/ml” til “0,063 μg/ml” samt 0 μg/ml kontrollen indeholde 150 μL opløsning, og det sidste rør, “0,031 μg/ml”, skal indeholde 300 μL opløsning. Dette skaber et tilstrækkeligt volumen af hver fortynding til at teste 50 μL af hver biotinyleret rhPD-L1-fortynding i dobbeltreaktioner, med tilstrækkeligt overskud tilbage til at rumme pipetteringstab. Tæl rhPD-1-koblede perler ved hjælp af et hæmocytometer17. De rhPD-1-koblede stamperler fortyndes til 5 × 104 perler/ml med et volumen, der er tilstrækkeligt til 2.500 perler/50 μL/reaktion. Vortex 5 × 104 perler/ml rhPD-1-koblet perlesuspension og pipette 50 μL af suspensionen i hver mærket/kortlagt brønd i en 96-brønds rundbundet mikrotiterplade, så der oprettes duplikatbrønde for hver rhPD-L1-fortynding, der testes. Der tilsættes 50 μL af hvert biotinyleret rhPD-L1-fortyndingsrør, der er skabt i trin 3.1, til de relevante huller på mikrotiterpladen. Mikrotiterpladen dækkes med en engangsfolie eller plastklæbepladeforsegler, og pladen inkuberes i 1 time i mørke ved RT (18-22 °C) på en orbitalryster (600 omdr./min.). Vask overskydende biotinyleret rhPD-L1 fra perlerne.Overfør den forseglede plade fra orbitalrysteren til magnetpladeseparatoren i 2 minutter for at immobilisere perlerne. Fjern forsigtigt klæbepladeforsegleren, bekræft, at magneten og mikrotiterpladen er sikkert sammen, vend pladen på hovedet, og deponer supernatanterne i en vask eller beholder med flydende affald ved biofarlig fare, alt efter hvad der er relevant. Bank forsigtigt, men hurtigt den omvendte plade på en pude af absorberende papirservietter for at fjerne den resterende supernatant. Mikrotiterpladen fjernes fra magnetpladeseparatoren, og der pipetteres 150 μL PBS-TBN i hvert hul. Placer den uforseglede plade på magnetseparatoren i 2 minutter for at immobilisere perlerne. Det bekræftes, at magneten og mikrotiterpladen er sikkert sammen, og vend pladen på hovedet, og supernatanterne hældes i en vask eller beholder med flydende affald ved biofarlig fare, alt efter hvad der er relevant. Bank forsigtigt, men hurtigt den omvendte plade på en pude af absorberende papirservietter for at fjerne den resterende supernatant. Vasketrin 3.7.3-3.7.5 gentages to gange for i alt tre vaske med hver 150 μL PBS-TBN. Sørg for, at der ikke er supernatant tilbage i hullerne ved afslutningen af det sidste vasketrin. Arbejd støt for at forhindre tørring af de immobiliserede perler på brøndbunden. Tilføj SAPE-detektionsreagens.SAPE-stamopløsningen fortyndes i PBS-TBN til en arbejdskoncentration på 6 μg/ml. Forbered et tilstrækkeligt SAPE-arbejdsløsningsvolumen, så alle reaktionsbrønde kan modtage 100 μL/brønd med tilstrækkeligt ekstra til at rumme pipetteringstab. Fjern mikrotiterpladen fra magnetpladeseparatoren. Tilsæt 100 μL SAPE-arbejdsløsning i hvert reaktionshul, og resuspender de vaskede perler ved pipettering. Mikrotiterpladen med 96 brønde forsegles med en folie- eller plastklæbepladeforsegler, og den inkuberes i 1 time i mørke ved RT (18-22 °C) på en orbitalryster ved 600 omdr./min. Mikrotiterpladen fjernes fra inkubatoren, overføres til magnetpladeseparatoren for at immobilisere perlerne, den klæbende pladeforsegler fjernes, og perlerne vaskes tre gange med 150 μL PBS-TBN, som beskrevet i trin 3.7.3-3.7.5. Når den endelige vask er fjernet, fjernes pladen fra magnetpladeseparatoren, og perlerne resuspenderes i 100 μL PBS-TBN pr. hul. Analyser resultaterne.Aflæs pladen på flowanalyseinstrumentet (se materialetabellen) for at bestemme medianfluorescensintensiteten (MFI) for hver reaktion ved hjælp af følgende instrumentindstillinger: aspirationsvolumen = 50 μL; minimum perleantal = 100 perler; timeout-indstilling = 40 s; gating = 7.000-17.000; driftstilstand = Enkelt reporter. Duplikerede brønde køres for hver betingelse, og de to output-MFI-værdier for hver betingelse beregnes som gennemsnit, før der udføres yderligere databeregning og graftegning.BEMÆRK: MFI-værdien for hver fortynding skal vise koncentrationsafhængig binding, hvilket indikerer acceptabel rhPD-1-koblingseffektivitet til perlerne og bekræfter god interaktion mellem de rekombinante PD-1/PD-L1-proteiner. 4. PD-L1 magnetisk perlebaseret PD-1 / PD-L1 blokerende assay BEMÆRK: Dette assay vurderer den blokerende aktivitet af opløselige mediatorer (fx anti-PDL1-peptidantistoffer) på rekombinante PD1/PD-L1-interaktioner. Kort fortalt præinkuberes biotinyleret rhPD-L1 med antistoffer genereret hos kaniner efter forskellige PDL1-Vaxx-peptidinokulationer. rhPD-L1 + anti-PDL1-antistofblandingen fanges derefter ved hjælp af rhPD-1-koblede magnetiske perler, og rhPD-L1-bindingen til de rhPD-1-koblede perler kvantificeres ved tilsætning af streptavidin-PE. PE-fluorescenssignalet korrelerer omvendt med blokeringsaktiviteten af de testede anti-PDL1-antistoffer/-hæmmere. Anti-PDL1-peptid-antistofbinding vurderes samtidigt ved binding af en BV421-koblet antikanin (for anti-PDL1-peptidantistoffer) eller anti-human (for kontrolantistoffer) sekundært antistof og ved evaluering af BV421-fluorescensen i instrumentets anden kanal. Analysetrinnene er billedligt beskrevet i figur 1. Der fremstilles en dobbelt seriel fortyndingsserie af testantistofferne, herunder PDL1-Vaxx-inducerede polyklonale antistofkandidater, et negativt kontrolantistof (trastuzumab, Herceptin, humaniseret anti-HER2 monoklonalt antistof) og et positivt kontrolantistof (atezolizumab; humaniseret anti-PDL1 IgG1 monoklonalt antistof). Hver reaktion vil bruge 25 μL af den tildelte antistoffortynding, så de viste volumener er tilstrækkelige til at udføre hver reaktion i dobbeltbrønde pr. tilstand (dvs. 50 μL pr. tilstand), med noget overskud tilbage til at rumme pipetteringstab.For hvert vaccineinduceret anti-PDL1-peptidantistof og kontrolantistof skal det sikres, at intervallet for de endelige antistofkoncentrationer, der testes, er fra 1.000 μg/ml ned til 8 μg/ml. Der fremstilles stamopløsninger af alle antistofferne ved 2.000 μg/ml. For hvert antistof mærkes fortyndingsglassene som 1.000 μg/ml, 500 μg/ml, 250 μg/ml, 125 μg/ml, 63 μg/ml, 31 μg/ml, 16 μg/ml og 8 μg/ml, og antistofnavnet angives. For hvert antistof tilsættes også et “0 μg/ml”-rør, som vil være den eneste køretøjskontrol (PBS-TBN).BEMÆRK: Når der tilsættes reaktionsblandingen, fortyndes antistofkoncentrationen 1:1. Antistoffortyndingsrørene er mærket som den endelige antistofkoncentration efter tilsætning til reaktionen og indeholder faktisk dobbelt så meget antistof end mærket. Der tilsættes 75 μL PBS-TBN til alle antistoffortyndingsrør mærket “500 μg/ml” og derunder, inklusive “0 μg/ml” reagensglas kun til køretøjet. For hvert antistof pipetteres 150 μL af 2.000 μg/ml stamopløsning i det respektive rør mærket “1.000 μg/ml”. Dette vil blive brugt til at lave alle de efterfølgende fortyndinger for hvert antistof. For hvert antistof oprettes en komplet fortyndingsserie ved pipetteoverførsel af 75 μL fra røret “1.000 μg/ml” til røret med den næste lavere fortynding i serien (dvs. “500 μg/ml”). Det nyligt færdigbyggede fortyndingsrør lukkes, hvirvles kortvarigt rundt, og fortyndingsserien fortsættes ved at overføre 75 μL fra røret “500 μg/ml” til røret “250 μg/ml”. Dette mønster gentages, indtil den sidste fortynding, “8 μg/ml”, er foretaget for alle antistofferne.BEMÆRK: I den færdige fortyndingsserie for hvert antistof skal der være et volumen på 75 μL for alle rørene undtagen den laveste fortynding, 8 μg/ml, som skal indeholde et volumen på 150 μL. Hver reaktion vil bruge 25 μL antistoffortynding, så disse volumener er tilstrækkelige til at udføre hver reaktion i dobbeltbrønde pr. tilstand (dvs. 50 μL pr. tilstand) med ekstra for at imødekomme pipetteringstab. 25 μL af de fortyndede antistoffer anbringes i de udpegede huller i en mikrotiterplade med 96 huller. Biotinyleret rhPD-L1 fortyndes til en arbejdskoncentration på 4 μg/ml i PBS-TBN i et volumen, der er tilstrækkeligt til at inkludere 25 μL i dobbeltbrønde pr. tilstand (dvs. 50 μL pr. tilstand), med ekstra for at tage højde for pipetteringstab.BEMÆRK: I dette arbejde resulterede biotinyleret rhPD-L1 ved 4 μg/ml i ca. 50% af det maksimale MFI-signal målt i den tidligere koblingsevaluering og blev brugt til PD-1/PD-L1-blokadeanalysen. Der tilsættes 25 μL biotinyleret rhPD-L1 (4 μg/ml) til hvert reaktionshul, mikrotiterpladen dækkes med en klæbeforsegling af folie eller plast, og der inkuberes ved RT (18-22 °C) i 1 time under omrystning på en orbitalpladeryster ved 600 omdr./min. De rhPD-1-koblede perler fortyndes til 50.000 perler/ml med et tilstrækkeligt volumen til 50 μL/brønd (2.500 perler/brønd) plus ekstra for at imødekomme pipetteringstab. Fjern mikrotiterreaktionspladen med 96 brønde fra rysteren, og fjern klæbepladeforseglingen. Der tilsættes 50 μL af rhPD-1-koblet perleblanding til hvert hul. Pladen forsegles, og der inkuberes i 1 time i mørke ved RT (18-22 °C) på en orbitalryster ved 600 omdr./min. Overfør den forseglede plade fra orbitalrysteren til magnetpladeseparatoren i 2 minutter for at immobilisere perlerne. Fjern forsigtigt klæbepladeforsegleren, kontroller, at magneten og mikrotiterpladen er sikkert sammen, vend pladen på hovedet, og supernatanterne dumpes. Bank forsigtigt den omvendte plade på en pude af absorberende papirserviet for at fjerne overskydende supernatant. Vask overskydende reaktionsreagenser fra perlerne.Mikrotiterpladen fjernes fra magnetpladeseparatoren, og der tilsættes 150 μL PBS-TBN til hvert hul. Placer mikrotiterpladen på magnetpladeseparatoren i 2 minutter for at immobilisere perlerne. Det kontrolleres, at magneten og mikrotiterpladen er sikkert sammen, og vend pladen på hovedet, og supernatanterne dumpes. Bank forsigtigt den omvendte plade på en pude af absorberende papirserviet for at fjerne overskydende supernatant. Pladevasketrin 4.11.1-4.11.3 gentages to gange i alt tre vaske med PBS-TBN. Sørg for, at SAPE-reagenset er fremstillet (nedenfor), før du fjerner den sidste (tredje) vaskeopløsning. Tilføj SAPE-detekteringsreagenset.SAPE-stamopløsningen fortyndes til en arbejdskoncentration på 6 μg/ml i PBS-TBN; lav et tilstrækkeligt volumen til 100 μL/brønd plus ekstra for at imødekomme pipetteringstab. Der tilsættes 100 μL/hul SAPE-arbejdsløsning i hvert reaktionshul, og perlerne resuspenderes ved pipettering. Pladen forsegles, og der inkuberes i 1 time i mørke ved RT (18-22 °C) på en orbitalryster ved 600 omdr./min. Dekanter overskydende SAPE fra reaktionen.Overfør den forseglede plade fra orbitalrysteren til magnetpladeseparatoren i 2 minutter for at immobilisere perlerne. Fjern forsigtigt klæbepladeforsegleren, kontroller, at magneten og mikrotiterpladen er sikkert sammen, vend pladen på hovedet, og dump supernatanten. Bank forsigtigt den omvendte plade på en pude af absorberende papirserviet for at fjerne supernatanten med overskydende SAPE. Vask overskydende SAPE af perlerne.Fjern mikrotiterpladen fra magnetpladeholderen. Der tilsættes 150 μL PBS-TBN til hvert hul for at genopsuspendere perlerne. Placer mikrotiterpladen på magnetpladeseparatoren i 2 minutter for at immobilisere perlerne. Kontroller, at magneten og mikrotiterpladen er sikkert sammen, vend pladen på hovedet, og dump supernatanten. Bank forsigtigt den omvendte plade på en pude af absorberende papirserviet for at fjerne overskydende supernatant. Udfør yderligere to vasketrin med PBS-TBN i i alt tre vaske ved at gentage trin 4.15.1-4.15.4. Få BV421-kongugerede sekundære detektionsantistoffer klargjort (næste trin), før du fjerner den endelige (tredje) vaskeopløsning. Tilføj BV421-kongugerede sekundære antistoffer.Fortyndet BV421-kongugeret anti-human IgG (til påvisning af humaniserede kontrolantistoffer) og BV421-kongugerede anti-kanin IgG (til påvisning af PDL1-Vaxx-inducerede polyklonale antistoffer) (se materialetabellen) 1:400 i vaske-/analysebuffer ved volumener, der er tilstrækkelige til at bruge 100 μL/hul af hver, med ekstra til at rumme pipetteringstab. Der tilsættes 100 μL fortyndet BV421-konjugeret anti-human IgG eller BV421-konjugeret antikanin IgG til de relevante huller. Pladen forsegles, og der inkuberes i 1 time i mørke ved RT (18-22 °C) på en orbitalryster ved 600 omdr./min. De overskydende BV421-konjugerede sekundære antistoffer dekanteres fra perlerne.Overfør den forseglede plade fra orbitalrysteren til magnetpladeseparatoren i 2 minutter for at immobilisere perlerne. Fjern forsigtigt klæbepladeforsegleren, kontroller, at magneten og mikrotiterpladen er sikkert sammen, vend pladen på hovedet, og dump supernatanten. Bank forsigtigt den omvendte plade mod en pude af absorberende papirserviet for at fjerne supernatanten indeholdende overskydende BV421-konjugerede sekundære antistoffer. Vask de overskydende BV421-konjugerede sekundære antistoffer fra perlerne.Der tilsættes 150 μL PBS-TBN til hvert hul for at genopsuspendere perlerne. Placer mikrotiterpladen på magnetpladeseparatoren i 2 minutter for at immobilisere perlerne. Kontroller, at magneten og mikrotiterpladen er sikkert sammen, vend pladen på hovedet, og dump supernatanten. Bank forsigtigt den omvendte plade på en pude af absorberende papirserviet for at fjerne overskydende supernatant. Udfør yderligere tre vasketrin med PBS-TBN i i alt fire vaske ved at gentage trin 4.19.1-4.19.3. Når den sidste (fjerde) vaskebuffer er fjernet, fjernes mikrotiterpladen fra magnetpladeseparatoren, og perlerne resuspenderes i 100 μL PBS-TBN/brønd med en pipetter. Analyser resultaterne.Læs pladen på dual-reporter flowanalysesystemet for at bestemme MFI for hver reaktion ved hjælp af følgende instrumentindstillinger: aspirationsvolumen = 50 μL; minimum perleantal = 100 perler; timeout-indstilling = 40 s; gating: 7.000-17.000; driftstilstand = Dual Reporter. Med dobbeltreportersystemet skal du sikre dig, at Reporter Channel 1 måler den orange PE-fluorescens (mængde rhPD-L1 bundet til rhPD-1-konjugerede perler) og Reporter Channel 2 måler den blå BV421-fluorescens (mængde vedhæftet blokerende antistof bundet til rhPD-L1). Kør dublerede brønde for hver betingelse, og gennemsnit de to output-MFI-værdier for hver betingelse, før du udfører yderligere databeregning og graftegning. Standardiser MFI-værdien for hver prøve til den negative kontrol, og beregn hæmningsprocenten for hver prøve:Hæmning% = (100 × [MFI for negativ kontrol – prøve MFI])/MFI for negativ kontrolBEMÆRK: MFI-værdierne for negativ kontrol (ingen hæmning) er de højeste værdier; det bundne PD-L1-signal MFI er 100%, og hæmningen af rhPD-L1-binding til rhPD-1 defineres som 0%. Figur 1: Skematisk oversigt over dobbeltreporteren PD-1/PD-L1 blokadeanalyse. Biotinyleret rekombinant humant PD-L1 (rhPD-L1) præinkuberes med udvalgte PDL1-Vaxx-inducerede anti-PDL1-antistoffer, før de kombineres med rhPD-1-koblede magnetiske perler for at tillade dannelse af PD-1/PD-L1 checkpoint-kompleks. Kompleksbundet rhPD-L1 detekteres derefter og markeres ved tilsætning af streptavidinkoblet phycoerythrin (SAPE, orange fluorofor). Antistoffer mod PDL1-Vaxx epitoper er rettet mod rhPD-L1, der er kompleksbundet til rhPD-1 forkoblet til de magnetiske perler, og de belyses ved hjælp af et strålende violet 421-konjugeret sekundært antistof (BV421, blå fluorofor). Både biotinyleret rhPD-L1, der er kompleksbundet til PD-1 (PE-signal) og anti-PDL1-antistoffer, der genkender og binder rhPD-L1 (BV421-signalet), analyseres samtidigt ved hjælp af et cytometrisk instrument med dobbeltreporterflow, der forhører prøver for begge fluoroforer i to separate reporterkanaler. Outputværdierne for hver prøve er medianfluorescensintensiteten for hver fluorofor. Inhiberingen af PD1/PD-L1-kompleksdannelse af forskellige PDL1-Vaxx-inducerede antistoffer ekstrapoleres derefter ved at sammenligne de eksperimentelle signaler med dem, der genereres ved anvendelse af et negativt kontrolmonoklonalt antistof, der ikke binder rhPD-L1 (0% hæmning). Klik her for at se en større version af denne figur.