1. Eksperimentell forberedelse MERK: Detaljene for alle reagensene/utstyret som er nevnt i dette trinnet, er oppført i materialfortegnelsen. Oppnå rekombinant human PD-1 (rhPD-1; polyhistidin-merket). Rekonstituer lyofilisert rhPD1 med sterilfiltrert fosfatbufret saltvann (PBS), pH 7,4, før bruk. Oppnå biotinylert rekombinant human PD-L1 (rhPD-L1). Rekonstituer lyofilisert rhPD-L1 med sterilt avionisert vann før bruk. Få streptapavidin-konjugert R-phycoerythrin detection reagent (SAPE). Oppbevar alle SAPE-oppløsninger beskyttet mot lys ved kjøleskapstemperaturer (dvs. 2-8 °C). Oppnå fluorescerende fargede magnetiske mikrosfærer (6,5 μm diameter, polystyren med innebygd magnetitt) og perlekoblingssettet15 (hvis brukt, se materialtabellen). Kovalent kobling til mikrosfærene krever sulfo-NHS (sulfo-N-hydrosuccinimid) og EDC (N-[3-dimetylaminopropyl]-N′-etylkarbodiimidhydroklorid).MERK: Magnetiske perlesett er tilgjengelige med noen av 500 unike fluorescerende koder, noe som gjør det mulig å identifisere og differensiere fra forskjellige perlesett16. Perler tilbys i lagerkonsentrasjoner på 2,5 × 106 perler / ml og 12,5 × 106 perler / ml. Oppbevar perlene beskyttet mot lys ved kjøleskapstemperaturer (dvs. 2-8 °C). Ikke frys perleopphengene. Få positive og negative kontrollantistoffer og Brilliant Violet 421 (BV421)-merkede sekundære deteksjonsantistoffer. Oppbevar alle fluorescerende konjugerte molekyler beskyttet mot lys. Utfør alle koblingsreaksjonene i lavproteinbindingsrør og alle analysereaksjonene i lavproteinbindende, rundbunns, 96-brønns mikrotiterplater. Forsegl platene med engangs klebende folie eller plast 96-brønns mikroplatedeksler for analysens inkubasjonstrinn. Bruk en magnetplateseparator til å immobilisere perlene under analysevasktrinnene.MERK: Strømningsanalysesystemet med dobbel reporter har tre lasere: (1) en som identifiserer og kvantifiserer dråpesettspesifikk fluorescens (klassifiseringskanal); (2) en som oppdager og kvantifiserer den målspesifikke phycoerythrin (PE) fluorescensen (Reporter Channel 1; 532 nm eksitasjon, “oransje” 565-585 nm utslipp); og (3) en som oppdager og kvantifiserer den målspesifikke BV421-fluorescensen til en andre målanalytt (Reporter Channel 2; 405 nm eksitasjon, “blå” 421-441 nm utslipp). 2. Kobling av rhPD-1 til magnetiske perler MERK: Proteinet som skal kobles må være fri for bovint serumalbumin (BSA), natriumazid, glycin, glyserol, tris (hydroksymetyl)aminometan (Tris) eller aminholdige tilsetningsstoffer og bør suspenderes i PBS ved pH 7,4. Et kommersielt koblingssett er tilgjengelig som inkluderer alle nødvendige reagenser og buffere beskrevet her (se materialfortegnelsen). Fjern alle koblingsreagensene fra kjøleskapet, og la dem likevekte til romtemperatur (RT, 18-22 °C) i 20-30 minutter. Resuspender stammikrosfærene ved kort virvel, sonikering eller rotering (15 minutter ved 15-30 o / min), i henhold til produktinformasjonsbladet. Overfør 1 × 106 magnetiske perler til et 1,5 ml mikrosentrifugerør med lav proteinbinding (se materialtabellen). Vaskeperler med 100 μL aktiveringsbuffer15: 0,1 M NaH2PO4 (monobasisk), pH 6,2.MERK: Kobling kan også utføres ved hjelp av et forhåndskonfigurert koblingssett, som inkluderer 0,1 M 2-morfolinetansulfonsyre (MES), pH 6,0, som en alternativ aktiverings- og koblingsbuffer (se materialtabellen).Plasser røret som inneholder perlene i en magnetisk separator i 1-2 min.MERK: Alternativt kan kulene separeres ved mikrosentrifugering ved ≥8000 × g i 1-2 min. Aspirer supernatanten med en pipette fra magnetimmobiliserte eller pelleterte perler med røret fortsatt plassert i magnetseparatoren. Fjern mikrosentrifugerøret fra magneten, og tilsett 80 μL koblingsbuffer (se materialtabellen). Vortex reaksjonsrøret forsiktig, og sonicate i 20 s for å spre perlene. Aktiver perlene med sulfo-NHS og EDC.MERK: Stamløsningen av sulfo-NHS er 50 mg / ml oppløst i aktiveringsbuffer. Stamløsningen av EDC er også 50 mg / ml oppløst i aktiveringsbuffer. Både aktiveringsbufferen og fuktigheten i atmosfæren forårsaker EDC-nedbrytning. Det anbefales ikke å bruke lagret EDC-løsning. Lag akkurat nok fersk EDC-løsning før trinnet, og bruk den umiddelbart når løsningen er klar. Kast overflødig EDC-oppløsning.FORSIKTIG: EDC forårsaker alvorlig øyeirritasjon og er luftveiene og hudirriterende.Tilsett 10 μL sulfo-NHS til mikrofugerøret som inneholder de vasket og aktiverte perlene. Tilsett 10 μL EDC-stamløsning til mikrofugerøret som inneholder perlene og sulfo-NHS. Beskytt de lysfølsomme mikrosfærene mot lys, og roter på rotatoren i 20 minutter ved 15-30 o / min, ved RT (18-22 ° C). Alternativt kan røret forbli stasjonært under aktiveringstrinnet hvis det er forsiktig virvelløst for å omfordele perlene med 10 minutters intervaller. Vask overflødige koblingsreagenser av perlene.Plasser røret som inneholder de aktiverte perlene i en magnetisk separator i 1-2 minutter. Aspirer supernatanten med en pipette fra magnetimmobiliserte eller pelleterte perler med røret fortsatt plassert i magnetseparatoren. Fjern mikrosentrifugerøret fra magneten, og tilsett 100 μL aktiveringsbuffer. Virv reaksjonsrøret forsiktig for å spre perlene. Gjenta trinn 2.6.1-2.6.4 to ganger til for totalt tre vask. Ved slutten av vasken vil perlene bli suspendert i 100 μL aktiveringsbuffer ved en omtrentlig konsentrasjon på 10 × 106 perler / ml. Koble rhPD-1-peptidet til de aktiverte perlene.Tilsett 390 mikrol aktiveringsbuffer til røret som inneholder de aktiverte kulene for å bringe det totale dråpesuspensjonsvolumet opp til 490 μL. Tilsett 1 μg PD-1-peptid til den aktiverte dråpesuspensjonen ved å tilsette 10 μL PD-1 peptidoppløsning (1 mg/ml oppløst i PBS) til røret som inneholder de aktiverte kulene. Virvel kort mikrosentrifugerøret for jevnt å fordele PD-1 og aktiverte perler. Inkuber kulene med PD-1 i 2 timer i mørket ved RT (18-22 °C) med rotasjon (15-30 o / min). Vask kulene to ganger (2x) med Assay/Wash Buffer (PBS-TBN: 1x PBS, pH 7,4 + 0,1% BSA + 0,05% Tween-20 + 0,05% NaN315).Plasser røret som inneholder de aktiverte perlene i en magnetisk separator i 1-2 minutter. Aspirer supernatanten med en pipette fra magnetimmobiliserte eller pelleterte perler med røret fortsatt plassert i magnetseparatoren. Fjern mikrosentrifugerøret fra magneten, og tilsett 100 μL aktiveringsbuffer. Virv reaksjonsrøret forsiktig for å spre perlene. Gjenta trinn 2.8.1-2.8.4 en ekstra gang for totalt to vasker. Ved slutten av vasken vil perlene bli suspendert i 100 μL aktiveringsbuffer i en konsentrasjon på 10 × 106 perler / ml.MERK: Assay/Wash-bufferen kan lages uten natriumazid (konserveringsmiddel) hvis bufferen ikke også brukes som lagringsmedium. Oppbevar de rhPD-1-koblede perlene i mørket i kjøleskapet ved 2-8 °C hvis de ikke brukes umiddelbart. Proteinkoblede perler er stabile i opptil 18 måneder. 3. Evaluering av vellykket rhPD-1-kobling til perlene MERK: De rhPD-1-koblede mikrosfærene reageres med biotinylert rhPD-L1, hvorav sistnevnte detekteres ved inkubasjon med SAPE etterfulgt av en vurdering på strømningscytometeret. Dette verifiserer både vellykket PD-1-kobling til magnetkulene og også funksjonell interaksjon mellom rhPD-1- og rhPD-L1-proteinene. Lag en todelt seriell fortynningsserie av biotinylert rhPD-L1 i PBS-TBN (stamløsningen rhPD-L1 er 1 mg/ml). Det endelige rhPD-L1-konsentrasjonsområdet som skal testes er en 8 μg / ml løsning ned til en 313 pg / ml løsning. Lag 150 μL volum av hver rhPD-L1-fortynning: 50 μL for hver reaksjon og to reaksjoner per tilstand, pluss tilstrekkelig overskudd til å imøtekomme pipetteringstap.Merk rhPD-L1 fortynningsmikrofugerør som 8 μg / ml, 4 μg / ml, 2 μg / ml, 1 μg / ml, 0,5 μg / ml, 0,25 μg / ml, 0,125 μg / ml, 0,063 μg / ml og 0,031 μg / ml. Et 0 μg / ml rør (kun PBS-TBN) fungerer som no-PD-L1-kontroll. Forspenning 150 μL PBS-TBN til alle merkede rhPD-L1 fortynningsrør.MERK: Den høyeste endelige rhPD-L1-konsentrasjonen som skal testes er 8 μg / ml, og rhPD-L1 vil bli fortynnet 1: 1 ved tilsetning til reaksjonsblandingen, slik at fortynningsrøret merket “8 μg / ml” refererer til den endelige konsentrasjonen og inneholder faktisk 16 μg / ml rhPD-L1. Etikettene på alle fortynningsrørene indikerer den endelige rhPD-L1-konsentrasjonen etter tilsetning til reaksjonen. Lag den høyeste konsentrasjonen rhPD-L1 fortynning (16 μg / ml faktisk). Dette er en to-trinns, 62,5 ganger fortynning av 1 mg/ml rhPD-L1 stamløsning (1000 μg/16 μg = 62,5).Kombiner 84 μL PBS-TBN med 16 μL rhPD-L1 stamløsning (1 mg/ml, dvs. 1000 μL) i et mikrosentrifugerør. Dette er en 6,25 ganger fortynning, og den resulterende konsentrasjonen er 160 μg / ml rhPD-L1. I røret merket “8 μg / ml” kombinerer du 270 μl PBS-TBN med 30 μL av rhPD-L1-fortynningen opprettet i forrige trinn (160 μg / ml). Dette er en 10 ganger fortynning, og den resulterende konsentrasjonen er faktisk 16 μg / ml. “8 μg / ml” røretiketten refererer til den endelige konsentrasjonen etter tilsetning til reaksjonen. Overfør 150 mikroliter av rhPD-L1-fortynningen opprettet i trinn 3.1.3 (“8 μg/ml”) til “4 μg/ml”-røret, lukk mikrosentrifugerørhetten og virvel kort for å blande oppløsningen. Gjenta trinn 3.1.4 sekvensielt til rhPD-L1-fortynningsserien er fullført. Etter opprettelse skal alle rørene mellom “8 μg / ml” til “0,063 μg / ml”, samt 0 μg / ml-kontrollen, inneholde 150 μL løsning, og det siste røret, “0,031 μg / ml”, skal inneholde 300 μL oppløsning. Dette skaper et tilstrekkelig volum av hver fortynning til å teste 50 μL av hver biotinylert rhPD-L1-fortynning i dupliserte reaksjoner, med tilstrekkelig overskudd igjen til å imøtekomme pipetteringstap. Telle rhPD-1-koblede perler ved hjelp av et hemocytometer17. Fortynn lageret rhPD-1-koblede perler til 5 × 104 perler / ml, med et volum tilstrekkelig for 2,500 perler / 50 μL / reaksjon. Vortex 5 × 104 perler / ml rhPD-1-koblet perlesuspensjon og pipette 50 μL av suspensjonen i hver merket / kartlagt brønn på en 96-brønns rundbunns mikrotiterplate slik at det opprettes dupliserte brønner for hver rhPD-L1-fortynning som testes. Tilsett 50 μL av hvert biotinylerte rhPD-L1 fortynningsrør opprettet i trinn 3.1 til de aktuelle brønnene på mikrotiterplaten. Dekk mikrotiterplaten med en engangsfolie eller plastplateforsegler, og inkuber platen i 1 time i mørket ved RT (18-22 °C) på en orbital shaker (600 o / min). Vask overflødig biotinylert rhPD-L1 fra perlene.Overfør den forseglede platen fra orbital shaker til magnetplateseparatoren i 2 minutter for å immobilisere perlene. Fjern forsiktig den selvklebende plateforsegleren, bekreft at magneten og mikrotiterplaten er ordentlig sammen, og snu platen og dump supernatantene i en vask eller beholder for biologisk farlig flytende avfall, etter behov. Bank forsiktig men raskt den omvendte platen på en pute av absorberende papirvev for å fjerne den gjenværende supernatanten. Fjern mikrotiterplaten fra magnetplateseparatoren, og pipett 150 μL PBS-TBN inn i hver brønn. Plasser den uforseglede platen på magnetseparatoren i 2 minutter for å immobilisere perlene. Bekreft at magneten og mikrotiterplaten er ordentlig sammen, og snu platen og dump supernatantene i en vask eller beholder for biologisk farlig flytende avfall, etter behov. Bank forsiktig men raskt den omvendte platen på en pute av absorberende papirvev for å fjerne den gjenværende supernatanten. Gjenta platevasketrinnene 3.7.3-3.7.5 to ganger for totalt tre vasker med 150 μL PBS-TBN hver. Forsikre deg om at det ikke er noen supernatant igjen i brønnene på slutten av det siste vasketrinnet. Arbeid jevnt for å forhindre tørking av de immobiliserte perlene på brønnbunnene. Legg til SAPE-deteksjonsreagens.Fortynn SAPE-stamløsningen i PBS-TBN til en arbeidskonsentrasjon på 6 μg/ml. Forbered et tilstrekkelig volum for SAPE-arbeidsløsningen slik at alle reaksjonsbrønnene kan motta 100 μL/brønn, med tilstrekkelig ekstra til å imøtekomme pipetteringstap. Fjern mikrotiterplaten fra magnetplateseparatoren. Tilsett 100 μL SAPE-arbeidsløsning i hver reaksjonsbrønn, og resuspender de vaskede perlene ved pipettering. Forsegle den 96-brønns mikrotiterplaten med en folie eller plastplateforsegler, og inkuber i 1 time i mørket ved RT (18-22 ° C) på en orbital shaker ved 600 o / min. Fjern mikrotiterplaten fra inkubatoren, overfør den til magnetplateseparatoren for å immobilisere perlene, fjern limplateforsegleren og vask perlene tre ganger med 150 μL PBS-TBN, som beskrevet i trinn 3.7.3-3.7.5. Etter å ha fjernet den endelige vasken, fjern platen fra magnetplateseparatoren, og resuspender perlene i 100 μL PBS-TBN per brønn. Analyser resultatene.Les platen på strømningsanalyseinstrumentet (se materialtabellen) for å bestemme median fluorescensintensitet (MFI) for hver reaksjon ved hjelp av følgende instrumentinnstillinger: aspirasjonsvolum = 50 μL; minimum antall perler = 100 perler; tidsavbruddsinnstilling = 40 s; gating = 7.000-17.000; driftsmodus = Single Reporter. Dupliserte brønner kjøres for hver tilstand, og de to MFI-utgangsverdiene for hver tilstand gjennomsnittes før ytterligere databeregning og grafisk fremstilling utføres.MERK: MFI-verdien for hver fortynning skal vise konsentrasjonsavhengig binding, noe som indikerer akseptabel rhPD-1-koblingseffektivitet til perlene og bekrefter god interaksjon mellom de rekombinante PD-1 / PD-L1-proteinene. 4. PD-L1 magnetisk perlebasert PD-1 / PD-L1 blokkeringsanalyse MERK: Denne analysen vurderer blokkeringsaktiviteten til løselige mediatorer (f.eks. anti-PDL1-peptidantistoffer) på rekombinante PD1 / PD-L1-interaksjoner. Kort fortalt er biotinylert rhPD-L1 preinkubert med antistoffer generert hos kaniner etter forskjellige PDL1-Vaxx peptidinokulasjoner. RhPD-L1 + anti-PDL1-antistoffblandingen fanges deretter ved bruk av rhPD-1-koblede magnetiske perler, og rhPD-L1-bindingen til rhPD-1-koblede perler kvantifiseres ved tilsetning av streptapavidin-PE. PE-fluorescenssignalet korrelerer omvendt med blokkeringsaktiviteten til de testede anti-PDL1-antistoffene / hemmerne. Anti-PDL1-peptidantistoffbinding vurderes samtidig ved binding av en BV421-koblet antikanin (for anti-PDL1-peptidantistoffer) eller anti-humant (for kontrollantistoffer) sekundært antistoff og ved å evaluere BV421-fluorescensen i instrumentets andre kanal. Analysetrinnene er billedlig detaljerte i figur 1. Klargjør en todelt seriell fortynningsserie av testantistoffene, inkludert PDL1-Vaxx-induserte polyklonale antistoffkandidater, et negativt kontrollantistoff (trastuzumab, Herceptin, humanisert anti-HER2 monoklonalt antistoff) og et positivt kontrollantistoff (atezolizumab; humanisert anti-PDL1 IgG1 monoklonalt antistoff). Hver reaksjon vil bruke 25 μL av den tildelte antistofffortynningen, slik at volumene som vises er tilstrekkelige til å utføre hver reaksjon i dupliserte brønner per tilstand (dvs. 50 μL per tilstand), med noe overskudd igjen for å imøtekomme pipetteringstap.For hvert vaksineindusert anti-PDL1-peptidantistoff og kontrollantistoff, sørg for at området for de endelige antistoffkonsentrasjonene som testes er fra 1000 μg / ml ned til 8 μg / ml. Klargjør stamløsninger av alle antistoffene ved 2000 μg/ml. For hvert antistoff, merk fortynningsrørene som 1000 μg / ml, 500 μg / ml, 250 μg / ml, 125 μg / ml, 63 μg / ml, 31 μg / ml, 16 μg / ml og 8 μg / ml, og inkluder antistoffnavnet. For hvert antistoff, legg også til et “0 μg / ml” -rør, som vil være kjøretøy-bare (PBS-TBN) -kontroll.MERK: Når det tilsettes reaksjonsblandingen, vil antistoffkonsentrasjonen bli fortynnet 1:1. Antistofffortynningsrørene er merket som den endelige antistoffkonsentrasjonen etter tilsetning til reaksjonen og inneholder faktisk dobbelt så mye antistoff enn merket. Tilsett 75 μL PBS-TBN til alle antistofffortynningsrørene merket “500 μg / ml” og under, inkludert “0 μg / ml” kjøretøykontrollrør. For hvert antistoff, pipett 150 μL av 2000 mikrogram / ml stamoppløsning i det respektive røret merket “1000 mikrogram / ml”. Dette vil bli brukt til å gjøre alle påfølgende fortynninger for hvert antistoff. For hvert antistoff lager du en komplett fortynningsserie ved å overføre 75 μl fra “1000 μg/ml”-røret til slangen med neste nedre fortynning i serien (dvs. “500 μg/ml”). Lukk det nylig ferdigstilte fortynningsrøret, virv det kort, og fortsett konstruksjonen av fortynningsserien ved å overføre 75 μL fra “500 μg/ml”-røret til “250 μg/ml”-røret. Gjenta dette mønsteret til den siste fortynningen, “8 μg/ml”, er gjort for alle antistoffene.MERK: I den ferdige fortynningsserien for hvert antistoff skal det være et volum på 75 μL for alle tubene unntatt den laveste fortynningen, 8 μg/ml, som skal inneholde et volum på 150 μL. Hver reaksjon vil bruke 25 μL antistofffortynning, så disse volumene er tilstrekkelige til å utføre hver reaksjon i dupliserte brønner per tilstand (dvs. 50 μL per tilstand), med ekstra for å imøtekomme pipetteringstap. Plasser 25 μL av de fortynnede antistoffene i de angitte brønnene til en 96-brønns mikrotiterplate. Fortynn biotinylert rhPD-L1 til en arbeidskonsentrasjon på 4 μg / ml i PBS-TBN i et volum tilstrekkelig til å inkludere 25 μL i dupliserte brønner per tilstand (dvs. 50 μL per tilstand), med ekstra for å imøtekomme pipetteringstap.MERK: I dette arbeidet resulterte biotinylert rhPD-L1 ved 4 μg / ml i omtrent 50% av det maksimale MFI-signalet målt i den tidligere koblingsevalueringen og ble brukt til PD-1 / PD-L1-blokkadeanalysen. Tilsett 25 μL biotinylert rhPD-L1 (4 μg / ml) til hver reaksjonsbrønn, dekk mikrotiterplaten med en folie eller plastlimforsegling, og inkuber ved RT (18-22 ° C) i 1 time med risting på en orbital platerister ved 600 o / min. Fortynn de rhPD-1-koblede perlene til 50 000 perler/ml, med et tilstrekkelig volum for 50 μL/brønn (2 500 perler/brønn) pluss ekstra for å imøtekomme pipetteringstap. Fjern den 96-brønns mikrotiterreaksjonsplaten fra shakeren, og fjern den selvklebende plateforseglingen. Tilsett 50 μL av rhPD-1-koblet perleblanding til hver brønn. Forsegle platen, og rug i 1 time i mørket ved RT (18-22 °C) på en orbital shaker ved 600 o / min. Overfør den forseglede platen fra orbital shaker til magnetplateseparatoren i 2 minutter for å immobilisere perlene. Fjern forsiktig den selvklebende plateforsegleren, bekreft at magneten og mikrotiterplaten er ordentlig sammen, og snu platen og dump supernatantene. Bank forsiktig på den omvendte platen på en pute av absorberende papirvev for å fjerne overflødig supernatant. Vask overflødig reaksjonsreagenser fra perlene.Fjern mikrotiterplaten fra magnetplateseparatoren, og tilsett 150 μL PBS-TBN til hver brønn. Plasser mikrotiterplaten på magnetplateseparatoren i 2 minutter for å immobilisere perlene. Bekreft at magneten og mikrotiterplaten er ordentlig sammen, og snu platen og dump supernatantene. Bank forsiktig på den omvendte platen på en pute av absorberende papirvev for å fjerne overflødig supernatant. Gjenta platevasketrinnene 4.11.1-4.11.3 to ganger, for totalt tre vasker med PBS-TBN. Forsikre deg om at SAPE-reagenset er tilberedt (nedenfor) før du fjerner den endelige (tredje) vaskeoppløsningen. Legg til SAPE-deteksjonsreagenset.Fortynn stamløsningens SAPE-lager til en arbeidskonsentrasjon på 6 μg/ml i PBS-TBN; lage et tilstrekkelig volum for 100 μL/brønn, pluss ekstra for å imøtekomme pipetteringstap. Tilsett 100 μL / brønn av SAPE-arbeidsløsning i hver reaksjonsbrønn, og resuspender perlene ved pipettering. Forsegle platen, og rug i 1 time i mørket ved RT (18-22 °C) på en orbital shaker ved 600 o / min. Dekanter overflødig SAPE fra reaksjonen.Overfør den forseglede platen fra orbital shaker til magnetplateseparatoren i 2 minutter for å immobilisere perlene. Fjern forsiktig den selvklebende plateforsegleren, bekreft at magneten og mikrotiterplaten er ordentlig sammen, og snu platen og dump supernatanten. Bank forsiktig på den omvendte platen på en pute av absorberende papirvev for å fjerne supernatanten som inneholder overflødig SAPE. Vask overflødig SAPE av perlene.Fjern mikrotiterplaten fra magnetplateholderen. Tilsett 150 μL PBS-TBN til hver brønn for å resuspendere perlene. Plasser mikrotiterplaten på magnetplateseparatoren i 2 minutter for å immobilisere perlene. Bekreft at magneten og mikrotiterplaten er ordentlig sammen, og snu platen og dump supernatanten. Bank forsiktig på den omvendte platen på en pute av absorberende papirvev for å fjerne overflødig supernatant. Utfør ytterligere to vasketrinn med PBS-TBN for totalt tre vasker ved å gjenta trinn 4.15.1-4.15.4. Få BV421-congugated sekundær deteksjonsantistoffer forberedt (neste trinn) før du fjerner den endelige (tredje) vaskeoppløsningen. Legg til BV421-congugated sekundære antistoffer.Fortynnet BV421-congugated anti-human IgG (for påvisning av humaniserte kontrollantistoffer) og BV421-congugated anti-rabbit IgG (for påvisning av PDL1-Vaxx-induserte polyklonale antistoffer) (se materialtabellen) 1:400 i vaske-/analysebuffer ved volumer som er tilstrekkelig til å bruke 100 μL/brønn av hver, med ekstra for å imøtekomme pipetteringstap. Tilsett 100 μL fortynnet BV421-konjugert anti-human IgG eller BV421-konjugert antikanin IgG til passende brønner. Forsegle platen, og rug i 1 time i mørket ved RT (18-22 °C) på en orbital shaker ved 600 o / min. Dekanter de overskytende BV421-konjugerte sekundære antistoffene fra perlene.Overfør den forseglede platen fra orbital shaker til magnetplateseparatoren i 2 minutter for å immobilisere perlene. Fjern forsiktig den selvklebende plateforsegleren, bekreft at magneten og mikrotiterplaten er ordentlig sammen, og snu platen og dump supernatanten. Bank forsiktig på den omvendte platen på en pute av absorberende papirvev for å fjerne supernatanten som inneholder overflødige BV421-konjugerte sekundære antistoffer. Vask overflødig BV421-konjugerte sekundære antistoffer fra perlene.Tilsett 150 μL PBS-TBN til hver brønn for å resuspendere perlene. Plasser mikrotiterplaten på magnetplateseparatoren i 2 minutter for å immobilisere perlene. Bekreft at magneten og mikrotiterplaten er ordentlig sammen, og snu platen og dump supernatanten. Bank forsiktig på den omvendte platen på en pute av absorberende papirvev for å fjerne overflødig supernatant. Utfør ytterligere tre vasketrinn med PBS-TBN for totalt fire vasker ved å gjenta trinn 4.19.1-4.19.3. Etter å ha fjernet den siste (fjerde) vaskebufferen, fjern mikrotiterplaten fra magnetplateseparatoren, og resuspender perler i 100 μL PBS-TBN / brønn med en pipettor. Analyser resultatene.Les platen på dual-reporter-strømningsanalysesystemet for å bestemme MFI for hver reaksjon ved hjelp av følgende instrumentinnstillinger: aspirasjonsvolum = 50 μL; minimum antall perler = 100 perler; tidsavbruddsinnstilling = 40 s; gating: 7.000-17.000; driftsmodus = Dual Reporter. Med dual-reporter-systemet, sørg for at Reporter Channel 1 måler den oransje PE-fluorescensen (mengde rhPD-L1 festet til rhPD-1-konjugerte perler) og Reporter Channel 2 måler den blå BV421-fluorescensen (mengde festet blokkerende antistoff bundet til rhPD-L1). Kjør dupliserte brønner for hver tilstand, og beregn gjennomsnittet av de to MFI-utgangsverdiene for hver tilstand før du utfører ytterligere databeregning og grafisk fremstilling. Standardiser MFI-verdien for hver prøve til den negative kontrollen, og beregne prosentandelen av hemming for hver prøve:Inhibisjon% = (100 × [Negativ kontroll MFI – Sample MFI]) / negativ kontroll MFIMERK: De negative kontroll-MFI-verdiene (ingen hemming) er de høyeste verdiene; det bundne PD-L1-signalet MFI er 100%, og inhiberingen av rhPD-L1-binding til rhPD-1 er definert som 0%. Figur 1: Skjematisk fremstilling av blokadeanalysen med dobbel reporter PD-1/PD-L1. Biotinylert rekombinant humant PD-L1 (rhPD-L1) pre-inkuberes med utvalgte PDL1-Vaxx-induserte anti-PDL1-antistoffer før de kombineres med rhPD-1-koblede magnetiske perler for å tillate dannelse av PD-1/PD-L1-kontrollpunktkompleks. Kompleks rhPD-L1 oppdages deretter og markeres ved tilsetning av streptapavidinkoblet phycoerythrin (SAPE, oransje fluorofor). Antistoffer mot PDL1-Vaxx-epitoper retter seg mot rhPD-L1 som har kompleksert til rhPD-1 forhåndskoblet til magnetkulene, og de belyses ved hjelp av et strålende fiolett 421-konjugert sekundært antistoff (BV421, blå fluorofor). Både biotinylert rhPD-L1 som er kompleksert til PD-1 (PE-signal) og anti-PDL1-antistoffer som gjenkjenner og binder rhPD-L1 (BV421-signalet) analyseres samtidig ved hjelp av et cytometrisk instrument med dobbel reporterflyt som undersøker prøver for begge fluoroforene i to separate reporterkanaler. Utgangsverdiene for hver prøve er median fluorescensintensitet for hver fluorofor. Inhiberingen av PD1/PD-L1-kompleksdannelse ved forskjellige PDL1-Vaxx-induserte antistoffer ekstrapoleres deretter ved å sammenligne de eksperimentelle signalene med de som genereres ved hjelp av et negativt monoklonalt antistoff som ikke binder rhPD-L1 (0% inhibering). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.