Крупномасштабное производство клеток на основе растворимых пористых микроносителей GMP-класса

Summary

Здесь мы представляем протокол для достижения крупномасштабного производства адгезивных клеток с помощью полностью закрытой системы на основе растворимых микроносителей GMP-класса. Культивирование мезенхимальных стволовых клеток человека, клеток HEK293T и клеток Vero было валидировано и соответствовало как количественным требованиям, так и критериям качества для индустрии клеточной и генной терапии.

Abstract

Исследователи в области клеточной и генной терапии (ВКТ) уже давно сталкиваются с серьезной проблемой эффективного и крупномасштабного размножения клеток. Чтобы устранить основные недостатки двумерной (2D) планарной системы культивирования, мы разработали инновационную платформу автоматизированного закрытого промышленного производства клеток (ACISCP) на основе растворимого и пористого микроносителя GMP-класса для 3D-культивирования адгезивных клеток, включая мезенхимальные стволовые/стромальные клетки человека (hMSCs), HEK293T клетки и клетки Vero. Для достижения крупномасштабного расширения было проведено двухступенчатое расширение с помощью биореакторов с перемешиванием объемом 5 л и 15 л с получением 1,1 x^{10 10} гМСК с общим расширением в 128 раз в течение 9 дней. Клетки собирали путем полного растворения микроносителей, концентрировали, промывали и формулировали с помощью системы обработки клеток на основе центрифуги непрерывного действия, а затем аликвотировали с помощью системы заполнения клеток. По сравнению с 2D планарной культурой нет существенных различий в качестве МСК, собранных из 3D-культуры. Мы также применили эти растворимые пористые микроносители к другим популярным типам клеток в секторе CGT; В частности, HEK293T клетки и клетки Vero культивировались до пиковой плотности клеток 1,68 x 10 7 клеток/мл и 1,08 x 10⁷ клеток/мл соответственно. В этом исследовании представлен протокол использования платформы биотехнологической инженерии, использующей характеристики растворимых микроносителей класса GMP и передового закрытого оборудования для производства адгезивных клеток в промышленных масштабах.

Introduction

За последние два десятилетия индустрия CGT стала свидетелем экспоненциального роста. Ожидается, что эволюция лекарственных средств нового поколения позволит лечить и излечивать многочисленные рефрактерные заболевания¹. С момента первого одобрения Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) продукта CGT Kymriah в 2017 году исследования и разработки, связанные с CGT, в мире продолжали расти быстрыми темпами, при этом FDA отмечает, что количество активных заявок на новые экспериментальные препараты для CGT увеличилось до 500 в 2018^году. Прогнозировалось, что к 2030 году количество одобренных продуктов CGT, вероятно, составит 54-74 в Соединенных^{Штатах.}

Несмотря на то, что быстрый рост исследований и инноваций в области CGT является захватывающим, все еще существует большой технологический разрыв между лабораторными исследованиями и производством в промышленных масштабах, который мог бы доставить эти перспективные лекарства для охвата такого количества пациентов, которое необходимо, по доступным ценам. Нынешние процессы, принятые для этих клинических испытаний, были разработаны в лабораториях для проведения небольших экспериментов, и необходимы значительные усилия для совершенствования и внедрения инноваций^{в производство} CGT. Существует множество типов продуктов CGT, большинство из которых основаны на живых клетках, которые могут быть аллогенными, аутологичными, инженерными или натуральными. Эти живые лекарства намного сложнее, чем мелкомолекулярные соединения или биологические препараты, что делает крупномасштабное производство серьезной проблемой ^4,5,6. В этой работе мы демонстрируем крупномасштабный протокол производства клеток для трех якорно-зависимых клеток, которые широко применяются в CGT. К ним относятся мезенхимальные стволовые/стромальные клетки человека (МСК), которые используются для клеточной терапии, а также клетки HEK293T и Vero, которые используются для производства вирусов для генной инженерии конечного терапевтического клеточного продукта. Клетки, зависящие от якорения, обычно культивируются на планарных системах, которые требуют ручной обработки. Однако ручные методы культивирования требуют значительного количества труда и подвержены загрязнению, что может поставить под угрозу качество конечного продукта. Кроме того, отсутствует поточный контроль процесса, что приводит к существенной вариабельности качества между партиями⁷. Если взять в качестве примера терапию стволовыми клетками, то с многообещающим портфелем из более чем 200 кандидатов на терапию стволовыми клетками, по оценкам, для удовлетворения потребностей клинического применения потребуется 300 триллионов МСК^в год8. Таким образом, крупномасштабное производство терапевтических клеток стало необходимым условием для проведения этих терапевтических вмешательств с такой^{высокой потребностью} в клетках.

Чтобы избежать неудач планарных систем, были предприняты усилия по разработке крупномасштабных производственных процессов в биореакторах с перемешиванием с обычными нерастворимыми микроносителями 10,11,12,13^, но они страдают от сложных процедур подготовки и низкой эффективности сбора клеток ¹⁴. Недавно мы разработали инновационный растворимый микроноситель для экспансии стволовых клеток, стремясь обойти проблемы, связанные с забором клеток из обычных нерастворимых коммерческих микроносителей¹⁵. Этот новый, коммерчески доступный 3D-растворимый пористый микроноситель 3D-класса GMP, 3D TableTrix, продемонстрировал большой потенциал для крупномасштабного производства клеток. Действительно, 3D-культура, основанная на этих пористых микроносителях, потенциально может воссоздать благоприятную биомиметическую микросреду для стимулирования клеточной адгезии, пролиферации, миграции^{и активации}. Пористые структуры и взаимосвязанные пористые сети микроносителей могут создавать большую площадь клеточной адгезии и способствовать обмену кислорода, питательных веществ и метаболитов, тем самым создавая оптимальный субстрат для клеточной экспансии in vitro ¹⁷. Высокая пористость этих растворимых пористых микроносителей 3D-класса GMP позволяет крупномасштабно расширять хМСК, а способность клеток полностью растворяться позволяет эффективно собирать эти расширенные клетки¹⁸. Он также является продуктом класса GMP и был зарегистрирован в качестве фармацевтического вспомогательного вещества в Китайском центре оценки лекарственных средств (регистрационные номера: F20210000003 и F20200000496)¹⁹ и FDA Соединенных Штатов (FDA, США; Номер главного дела о наркотиках: 35481)²⁰.

Здесь мы проиллюстрируем автоматизированную систему производства ячеек закрытого промышленного масштаба (ACISCP)¹⁸, использующую эти диспергируемые и растворимые пористые микроносители для hMSC, HEK293T cell и расширения клеток Vero. Мы добились успешного двухуровневого расширения МСК (128 кумулятивных расширений за 9 дней) из биореактора объемом 5 л в биореактор объемом 15 л и, наконец, получили до 1,1 x 10¹⁰ МСК из одной партии продукции. Клетки собирали путем полного растворения микроносителей, концентрировали, промывали и формулировали с помощью системы обработки клеток на основе центрифуги непрерывного действия, а затем аликвотировали с помощью системы заполнения клеток. Кроме того, мы оценили качество продуктов hMSC для подтверждения соответствия. Мы также продемонстрировали применение этих растворимых микроносителей для масштабного производства двух других типов ячеек крепления, ячеек HEK293T и клеток Vero, которые широко применяются в отрасли CGT. Пиковая плотность клеток HEK293T клеток достигала 1,68 x 10 7 клеток/мл, тогда как пиковая плотность клеток Vero достигала 1,08 x 10⁷ клеток/мл. Система ACISCP может быть адаптирована для культивирования различных адгезивных клеток, и потенциально она может стать мощной платформой, способствующей ускорению индустриализации CGT.

Protocol

Человеческая пуповина была получена из пекинской больницы Цинхуа Чангэн. Все процедуры и протоколы, касающиеся получения, выделения и культивирования мезенхимальных стволовых клеток пуповины человека (ВЦМСК), проводились с информированного согласия и с одобрения Комитета по этике Пе…

Representative Results

Платформа ACISCP представляет собой полностью закрытую систему, в которой используется ряд биореакторов с перемешиванием для расширения масштабирования, система обработки клеток для автоматизированного сбора и составления клеточных формулировок, а также система наполнения клеток (<stron…

Discussion

Как иммунотерапия, так и терапия стволовыми клетками используют живые клетки в качестве лекарств; Однако их конечные продукты не должны очищаться или стерилизоваться так же, как малые молекулы или вирусы. Таким образом, принцип качества по проектированию (QbD) всегда должен иметь в виду ?…

Materials

0.25% trypsin EDTA	BasalMedia	S310JV	Used for 2D cell harvest.
3D FloTrix Digest	CytoNiche Biotech	R001-500	This is a reagent that specifically dissolves 3D TableTrix microcarriers.
3D FloTrix MSC Serum Free Medium	CytoNiche Biotech	RMZ112	This is a serum-free,animal-free medium for mesenchymal stem cell expansion and maintenance in 2D planar culture as well as 3D culture on 3D TableTrix microcarriers.
3D FloTrix Single-Use Filtration Module	CytoNiche Biotech	R020-00-10	This module contains 0.22 μm capsule filters used for filtration of culture medium and digest solution.
3D FloTrix Single-Use Storage Bag (10 L)	CytoNiche Biotech	R020-00-03	Used as feed bag for 5 L bioreactor.
3D FloTrix Single-Use Storage Bag (3 L)	CytoNiche Biotech	R020-00-01	Used as cell seeding or transfer bags.
3D FloTrix Single-Use Storage Bag (50 L)	CytoNiche Biotech	R020-00-04	Used as feed bag for 15 L bioreactor.
3D FloTrix vivaPACK Disposable Fill&Finish Consumable Kit	CytoNiche Biotech	PACK-01-01	This is a standard kit adapted to 3D vivaPACK fill and finish system.
3D FloTrix vivaPACK fill and finish system for cells	CytoNiche Biotech	vivaPACK	This system is a closed liquid handling device, with automated mixing and gas exhausting functions. Cells resuspended in cryopreservation buffer can be rapidly and evenly aliquoted into 20 bags per batch.
3D FloTrix vivaPREP PLUS cell processing system	CytoNiche Biotech	vivaPREP PLUS	This system is a continuous flow centrifuge-based device.Cells can be concentrated, washed, and resuspended under completely closed procedures.
3D FloTrix vivaPREP PLUS Disposable Cell Processing Kit	CytoNiche Biotech	PREP-PLUS-00	This is a standard kit adapted to 3D vivaPREP PLUS cell processing.
3D FloTrix vivaSPIN  bioreactor 15 L	CytoNiche Biotech	FTVS15	This bioreactor product employs a controller, a 15 L glass stirred-tank vessel, and assessories. A special perfusion tube is available.
3D FloTrix vivaSPIN  bioreactor 5 L	CytoNiche Biotech	FTVS05	This bioreactor product employs a controller, a 5 L glass stirred-tank vessel, and assessories.A special perfusion tube is available.
3D FloTrix vivaSPIN Closed System Consumable Pack (10/15 L)	CytoNiche Biotech	R020-10-10	This is a standard tubing kit adapted to 3D vivaSPIN bioreactor 15 L, containing sampling bags.
3D FloTrix vivaSPIN Closed System Consumable Pack (2/5 L)	CytoNiche Biotech	R020-05-10	This is a standard tubing kit adapted to 3D vivaSPIN bioreactor 5 L, containing sampling bags.
3D TableTrix microcarriers G02	CytoNiche Biotech	G02-10-10g	These porous and degradable microcarriers are suitable for HEK293T cell culture. They come pre-sterilized in 10g/bottle with C-Flex tubings for welding to tubes on bioreactors.
3D TableTrix microcarriers V01	CytoNiche Biotech	V01-100-10g	These porous and degradable microcarriers are suitable for adherent cell culture, they come as non-sterilized microcarriers that need to be autoclaved in PBS before use. They are especially suitable for vaccine production.
3D TableTrix microcarriers W01	CytoNiche Biotech	W01-10-10g (single-use packaging); W01-200 (tablets)	These porous and degradable microcarriers are suitable for adherent cell culture, especially for cells that need to be harvested as end products. They come pre-sterilized in 10g/bottle with C-Flex tubings for welding to tubes on bioreactors.The product has obtained 2 qualifications for pharmaceutical excipients from CDE, with the registration numbers of [F20200000496; F20210000003]. It has also received DMF qualification for pharmaceutical excipients from FDA, with the registration number of [DMF:35481]
APC anti-human CD45 Antibody	BioLegend	368512	Used in flow cytometry for MSC identity assessment
Calcein-AM/PI Double Staining Kit	Dojindo	C542	Calcein-AM/PI Double Staining Kit is utilized for simultaneous fluorescence staining of viable and dead cells. This kit contains Calcein-AM and Propidium Iodide (PI) solutions, which stain viable and dead cells, respectively.
Cap for EZ Top Container Closures for NALGENE-containers (500mL)	Saint-Gobain	CAP-38	Brands and catalogue numbers are only for example, similar products are available from various suppliers and as long as they have the same functionality, items could be substituted with other brands.
C-Flex Tubing, Formulation 374 (0.25 in x 0.44 in)	Saint-Gobain	374-250-3	Used for tube welding and disconnection.
CryoMACS Freezing Bag 50	Miltenyi Biotec	200-074-400	Used for expanding the 3D FloTrix vivaPACK Disposable Fill&Finish Consumable Kit.
Dimethyl Sulfate (DMSO)	Sigma	D2650-100mL	Used for preparation of cryopreservation solution.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	BasalMedia	L120KJ	Used for cultivation of HEK293T and Vero cells.
DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (2 L)	DWK life sciences	218016357	Used for waste collection from the 5 L bioreactor.
DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (5 L)	DWK life sciences	218017353	Used for waste collection from the 15 L bioreactor.
DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (500 mL)	DWK life sciences	218014459	Used for supplementary bottle of 0.1 M NaOH.
EZ Top Container Closures for NALGENE-containers (500mL)	Saint-Gobain	EZ500 ML-38-2	Brands and catalogue numbers are only for example, similar products are available from various suppliers and as long as they have the same functionality, items could be substituted with other brands.
Fetal bovine serum (FBS) superior quality	Wisent	086-150	Used for cultivation of HEK293T cells.
FITC anti-human CD14 Antibody	BioLegend	301804	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
FITC anti-human CD34 Antibody	BioLegend	343504	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
FITC anti-human CD90 (Thy1) Antibody	BioLegend	328108	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
Flow cytometry	Beckman Coulter	CytoFLEX	Used for cell identity assessment.
Fluorescence Cell Analyzer	Alit life science	Countstar Rigel S2	Used for cell counting. Cell viability can be calculated by staining with AO/PI dyes.
GL 45 Multiport Connector Screw Cap with 2 ports	DWK life sciences	292632806	Brands and catalogue numbers are only for example, similar products are available from various suppliers and as long as they have the same functionality, items could be substituted with other brands.
Glucose Meter	Sinocare	6243578	Used for detecting glucose concentration in cell culture medium and supernatant.
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), with calcium and magnesium	Gibco	14025092	Used for preparation of digest solution.
Human Albumin 20% Behring (HSA)	CSL Behring	N/A	Used for preparation of wash buffer.
Inverted fluorescent microscope	OLYMBUS	CKX53SF	Used for brifgt field and fluorescent observation and imaging.
Nalgene Measuring Cylinder (500 mL)	Thermo Scientific	3662-0500PK	Used for calibrating the liquid handling volume speed of peristaltic pumps.
Newborn calf serum (NBS) superfine	MINHAI BIO	SC101.02	Used for cultivation of Vero cells.
OriCell human mesenchymal stem cell adipogenic differentiation and characterization kit	Cyagen	HUXUC-90031	Used for tri-lineage differentiation of hUCMSCs.
OriCell human mesenchymal stem cell chondrogenic differentiation and characterization kit	Cyagen	HUXUC-90041	Used for tri-lineage differentiation of hUCMSCs.
OriCell human mesenchymal stem cell osteogenic differentiation and characterization kit	Cyagen	HUXUC-90021	Used for tri-lineage differentiation of hUCMSCs.
PE anti-human CD105 Antibody	BioLegend	800504	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
PE anti-human CD19 Antibody	BioLegend	302208	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
PE anti-human CD73 (Ecto-5'-nucleotidase) Antibody	BioLegend	344004	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
PE anti-human HLA-DR Antibody	BioLegend	307605	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Wisent	311-010-CL	Used in autoclaving of glass vessel and V01 microcarriers, and replacement of culture medium.
Sani-Tech Platinum Cured Sanitary Silicone Tubing (0.13 in x 0.25 in)	Saint-Gobain	ULTRA-C-125-2F	Used for solution transfering driven by peristaltic pumps.
Sterile Saline	Hopebiol	HBPP008-500	Used for preparation of wash buffer.
Trypzyme Recombinant Trypsin	BasalMedia	S342JV	This reagent is used for bead-to-bead transfer of HEK293T and Vero cells.
Tube Sealer	Yingqi Biotech	Tube Sealer I	This sealer is compatible with both C-Flex tubing and PVC tubing.
Tube Welder for PVC tubing	Chu Biotech	Tube Welder Micro I	Used for welding of PVC tubing.
Tube Welder for TPE tubing	Yingqi Biotech	Tube Welder I-V2	Used for welding of TPE tubing.
ViaStain AO / PI Viability Stains	Nexcelom	CS2-0106-25mL	Dual-Fluorescence Viability, using acridine orange (AO) and propidium iodide (PI), is the recommended method for accurate viability analysis of primary cells, such as PBMCs, and stem cells in samples containing debris.