Den præsenterede cervikale manipulationsmetode kan fremkalde pseudograviditet hos mus uden behov for avlshunner med vasektomiserede hanner. Induktion af pseudograviditet er nødvendig for succes med ikke-kirurgisk embryooverførsel og ikke-kirurgisk kunstig insemination, som begge også præsenteres.
For at kunne opretholde graviditet med ægoplægning eller kunstig befrugtning skal hunrecipientmus induceres i en pseudogravid tilstand. Hunmus parres traditionelt natten over med vasektomiserede hanner, og den følgende morgen vurderes tilstedeværelsen af en kopulationsprop. For at øge effektiviteten af at producere pseudogravide kvinder er en cervikal manipulationsteknik blevet standardiseret til at blive brugt i kombination med ikke-kirurgisk embryooverførsel eller kunstig befrugtningsteknikker hos mus. Den stumpe ende af en lille plaststang indsættes vaginalt for at kontakte livmoderhalsen og vibreres i 30 s ved kontakt med en trimmer. Proceduren er hurtig og kræver ikke anæstesi eller analgesi. Denne teknik øger pålideligheden og forudsigeligheden ved at producere pseudogravide kvinder og eliminerer helt kravet om vasektomiserede mænd. For CD1-mus var effektiviteten af pseudograviditetsinduktion ved hjælp af cervikal manipulation 83% for kvinder i østrus (N = 76), men kun 38% af hunnerne i østrus blev tilsluttet af vasektomiserede mænd (N = 24). Kunstig befrugtning i CD1-mus blev udført ved østrussynkronisering med hormoner, cervikal manipulation og livmoderoverførsel af sædceller. Modtagere af kunstig befrugtning, der fik cervikal manipulation (N = 76), havde en drægtighedsrate på 72% og en gennemsnitlig kuldstørrelse på 8,3 hvalpe. Denne metode kan også anvendes til fremstilling af pseudogravide hunner til ikke-kirurgisk embryooverførsel. Derfor er inducering af pseudograviditet ved cervikal manipulation et bekvemt og effektivt alternativ til parring med en vasektomiseret mand, når der udføres ikke-kirurgiske assisterede reproduktionsteknikker. Brug af cervikal manipulation giver 3R’er (udskiftning, reduktion og forfining) fordele for assisteret reproduktionsteknikker ved at reducere antallet af krævede dyr og eliminere behovet for kirurgisk ændrede mænd.
Assisteret reproduktionsteknologi anvendes til fremstilling af genetisk modificerede musemodeller samt genopretning af stammer fra kryopræservering, rederivation af stammer fra en kompromitteret sundhedsstatus og strategisk vivariumstyring, herunder produktion af aldersmatchede kohorter. Alle assisterede reproduktionsteknikker i mus kræver brug af pseudogravide kvindelige modtagere til embryoudvikling. Historisk set er pseudogravide modtagere blevet genereret ved parring med sterile hanner, som enten er kirurgisk vasektomiserede eller genetisk ufrugtbare, og tilstedeværelsen af en kopulationsprop vurderes den følgende morgen1. For nylig er der udviklet en protokol til sonisk stimulering hos mus til kirurgisk overførsel af pronukleære eller tocellede museembryoner2. Vi har også udviklet en cervikal manipulation (CM) protokol til brug ved kunstig befrugtning og ikke-kirurgisk embryooverførsel af blastocyster. Begrundelsen for anvendelsen af proceduren er at give en 3R-reduktion i antallet af dyr, der kræves (kræver ikke længere hanmus) og en forbedring af de anvendte teknikker (hvilket ikke længere nødvendiggør kirurgisk vasektomiprocedure for hanmus). Beskrivelsen af denne protokol inkluderer den tilhørende assisterede reproduktionsteknik til at hjælpe med integrationen af CM i normale arbejdsgange. Det overordnede mål med CM-metoden er at erstatte brugen af hanmus i genereringen af pseudogravide hunner til assisteret reproduktionsteknik, herunder kunstig befrugtning og embryooverførsel.
CM-protokollen, der beskrives her, blev først udviklet til at hjælpe med kunstig befrugtning hos mus. Den kunstige inseminationsprotokol, som oprindeligt beskrevet, opnåede en drægtighedsrate på 50% med en gennemsnitlig kuldstørrelse på 7 hvalpe3. CD1-modtagermus blev brunst synkroniseret med en lav dosis hormoner, herunder drægtige hoppererumgonadotropin (PMSG) og humant choriongonadotropin (hCG), med et interval på 47 timer før insemination. En fordel ved østrussynkronisering var, at det tillod brugen af protokollen inden for normal arbejdstid. Kvinder blev parret med vasektomiserede mænd umiddelbart efter kunstig befrugtning, og parring blev bekræftet ved tilstedeværelsen af en kopulationsprop. Inkonsekvens i parringsraten med recipienterne blev rapporteret som et problem i proceduren. Derfor blev alternativer til parring søgt til induktion af pseudograviditet.
Denne undersøgelse præsenterer en standardiseret CM-teknik til at øge effektiviteten af at producere pseudogravide kvinder. For kvinder i østrus eller proestrus indsættes den stumpe ende af en lille plaststang vaginalt for at kontakte livmoderhalsen og vibreres i 30 s ved kontakt med en trimmer. Proceduren udføres på et trådstoppet bur. Ingen anæstesi eller analgesi er påkrævet. CM-teknikken er praktisk til fremstilling af pseudogravide kvinder, som kan producere kuld efter ikke-kirurgisk kunstig befrugtning uden behov for parring med vasektomiserede mænd. CM kan også anvendes til produktion af pseudogravide hunner som modtagere af embryooverførsel. Specifikt kan CM-teknikken parres med ikke-kirurgisk embryooverførsel, som beskrevet her. Ikke-kirurgiske metoder har vist sig at være effektive til embryooverførsel af blastocyst-embryoner hos mus 4,5og rotter 6,7. Da denne ikke-kirurgiske metode er et effektivt alternativ til kirurgiske metoder, betragtes det som en 3R-forfining af teknikken. Baseret på tidligere forskning indikerer fækale corticosteronniveauer som et mål for stress, at procedurens ikke-kirurgiske karakter ikke øger stressniveauet hos gnavere 7,8. Procedurerne er mindre teknisk udfordrende end kirurgisk embryooverførsel og er meget hurtigere at udføre. Da embryonerne overføres til livmoderen, skal embryoner af det korrekte stadium for livmoderudvikling overføres. For mus overføres blastocyster til 2,5 dage efter coitum (dpc) pseudogravide modtagere.
For de to ikke-kirurgiske teknikker, der er beskrevet her, er timingen af hormonadministrationen og CM-teknikken forskellig. Tidspunktet for CM-proceduren i forhold til østrus er vigtig for succes, da den erstatter naturlig parring til produktion af pseudogravide modtagere. Ved at eliminere behovet for vasektomiserede mænd til at fremkalde pseudograviditet giver denne procedure 3R-fordele ved både at reducere antallet af dyr, der kræves, og eliminere behovet for kirurgisk ændrede mænd. Selve proceduren er hurtig (30 s) og kræver ikke anæstesi eller analgesi. Teknikken øger i høj grad pålideligheden og forudsigeligheden ved at producere pseudogravide kvinder til assisteret reproduktion.
3R’erne er en etisk ramme for dyrebrug i forskning, som beskrevet i 1959 af Russel og Burch i “The Principles of Humane Experimental Technique”15. 3R’erne repræsenterer udskiftning, reduktion og forfining i dyrebrug. De protokoller, der er fremhævet her, er i overensstemmelse med 3R’erne. Den cervikale manipulationsteknik reducerer antallet af dyr, der er nødvendige ved ikke længere at kræve brug af mænd til at producere pseudogravide kvinder. Teknikken eliminerer også behovet for at udføre vasektomier på hannerne, hvilket giver forfining ved at reducere smerte og nød. De assisterede reproduktionsteknikker, der er beskrevet her (kunstig befrugtning og embryooverførsel), er ikke-kirurgiske og giver således begge en 3R-forfining ved at reducere smerte og nød8forårsaget af deres kirurgiske alternativer.
Anvendelsen af pseudogravide kvinder er nødvendig for genopretning af hvalpe, når der udføres assisteret reproduktion hos mus1. CM-proceduren er en effektiv metode til fremstilling af pseudogravide kvinder, men synkroniseringen af fasen af brunstcyklussen hos modtagerhunnerne er et kritisk første skridt i processen. Brunstsynkronisering kan drastisk reducere antallet af hunner, der er nødvendige i kolonien for at forberede potentielle modtagere og hjælper med at producere tidsbestemte pseudogravide hunner efter behov. Brug af en lav dosis hormoner synes ikke at forårsage nogen skadelige virkninger på genopretningen af levende kuld i CD1-mus. Der skal udvises forsigtighed med andre stammer for at finde den hormon- og koncentrationskombination, der producerer recipienthunner af bedste kvalitet til de overførte embryoner eller sædceller. Synkronisering kan opnås ved hjælp af PMSG og hCG16, men doser, der producerer superovulerede kvinder, er muligvis ikke egnede til en vedvarende graviditet17.
For at afgøre, om en kvinde er i østrus, blev der udført en cytologisk evaluering i dette arbejde. Brunstfasen kan også evalueres ved observation af vaginalåbningen11,18. Selvom denne metode er yderst nyttig og kan bruges alene eller som bekræftelse, er den mere subjektiv end brugen af cytologi. Vaginal cytologi uden farvning er både hurtig og effektiv til valg af kvinder i østrus, fordi cornified epitelceller let kan identificeres. I denne protokol udføres den cytologiske evaluering før CM for at bestemme potentielle modtagere. Det er vigtigt at udføre cytologi før CM, da proceduren har tendens til at fragmentere cellerne, der sloughed fra vaginalområdet, hvilket gør identifikation vanskelig. Cytologisk evaluering for pseudograviditet eller graviditet kan udføres 3,5-11,5 dage efter CM (dpcm) i 3 på hinanden følgende dage. Profilen af en østruscyklende kvinde skal have mindst 1 dag med betydelig infiltration af cornified epitelceller. Pseudogravide/gravide kvinder bør udvise en diestrusprofil (for det meste leukocytter med potentielt lave celletal) i 3 på hinanden følgende dage.
Gennem udviklingen af CM-teknikken viste det sig, at nogle mus var mere modtagelige for proceduren end andre. CD1 hunmus er fremragende kandidater på grund af deres rolige natur og fremragende plejeinstinkter. Denne stamme er nem at håndtere og fungerer godt under CM og ikke-kirurgiske assisterede reproduktionsteknikker. C57Bl/6-mus har tendens til at være mere aggressive og mindre plejende. Mens denne protokol effektivt producerede pseudogravide C57Bl / 6-kvinder ved hjælp af CM, var de mindre tilbøjelige til at være konsekvent eftergivende over for proceduren. Dette syntes at korrelere noget med østrusfasen under CM. Kvinder i østrus eller proestrus var mere modtagelige. Brugen af et berigelsesrør for dyret at komme ind tillod adgang til vagina til proceduren og hjalp med at berolige kvinden. Selve proceduren begrænser ikke kvinden fuldt ud, så dyret kan trække sig væk til enhver tid. Hvis dette sker, kan dyret flyttes, og proceduren kan derefter fortsættes. Tidspunktet for proceduren stopper, hvis kvinden går væk og genoptages, når proceduren genoptages. Kritisk for procedurens succes er fasen af østruscyklussen (sen proestrus og østrus) og stangens kontakt med livmoderhalsen. Trimmerens vibrationer giver standardiseret CM. For at sikre kontakt med livmoderhalsen påføres stangen et let tryk, og stangens placering mod livmoderhalsen sikres med små frem og tilbage bevægelser af stangen.
Brugen af CM har forbedret NSAI-protokollen, da kvinder i den korrekte fase af østruscyklussen kan vælges inden sædoverførsel, og protokollen er ikke længere betinget af parring med vasektomiserede hanner. Den kunstige befrugtning af østruscyklussynkroniseringen er tidsindstillet således, at oocytmodning svarer til sædoverførsel om morgenen på dag 4. Afgørende for protokollens succes er tilpasningen af tidspunktet for ægløsning, således at befrugtning kan forekomme. Der skal udvises forsigtighed med at administrere hCG 15-17 timer før forventet sædoverførsel, som det foreslås for de tidspunkter, der anvendes til in vitro-befrugtning 1. Kvaliteten af sædprøven vil direkte påvirke resultatet af kunstig befrugtning. Frisk sæd, der er blevet kapaciteret, vil fungere bedst. Kryopræserveret sæd af god kvalitet kan producere befrugtede embryoner in vivo. Der skal dog udvises forsigtighed ved direkte overførsel af optøet sæd, da resterende kryoprotektorer, der overføres til livmoderhornet, kan hæmme implantation (upublicerede observationer).
Brugen af CM i forbindelse med embryooplægning er konceptuelt en nem tilpasning. Synkronisering af østruscyklus reducerer antallet af kvinder, der er nødvendige for at producere modtagerpuljen. Bestemmelse af brunststadiet før CM øger sandsynligheden for at opnå pseudogravide modtagere. En ulempe ved metoden er, at modtagernes cytologi på tidspunktet for embryooverførsel er i et fluxstadium. Alle celletyper er til stede, hvis kvinden overgår fra østrus til pseudograviditetsprofilen, og pseudograviditet bliver kun indlysende, hvis cytologien spores i flere dage. Baseret på succesen (>80%) af overgangen fra østrus til pseudograviditet for CD1- og C57Bl/6-mus forventes denne metode at være egnet til embryooverførselsmodtagere. De foreløbige resultater viser god succes med begrænset ikke-kirurgisk embryooverførsel. Generelt er effektiviteten af ikke-kirurgisk embryooplægning sammenlignelig med effektiviteten af den kirurgiske teknik4,5, og ikke-kirurgisk oplægning kan erstatte kirurgisk embryooplægning på blastocyststadiet. For embryoner i tidligere stadier kræves embryodyrkning til blastocyststadiet. Men hvis en kirurgisk overførsel foretrækkes, er det muligt at tilpasse CM-teknikken til den korrekte timing, der er nødvendig for passende pseudogravide modtagere2. Generelt er embryorecipienterne 1 dag mindre fremskredne end embryoet. For eksempel høstes blastocyster ved 3,5 dpc fra donorer og overføres til 2,5 dpc-modtagere. Derfor skal CM udføres således, at modtageren er i en mindre udviklet pseudogravid tilstand end embryonerne.
Afslutningsvis viser CM-teknikken, der er skitseret her, fremragende løfte om integration med andre assisterede reproduktionsteknikker til mus. Vi har leveret vellykkede protokoller til kunstig befrugtning og embryooverførsel ved hjælp af ikke-kirurgiske teknikker. I kombination giver CM-teknikken 3R-fordele, herunder (1) en reduktion i antallet af dyr ved at eliminere behovet for vasektomiserede mænd og (2) en forfining af teknikker ved at erstatte kirurgiske teknikker med ikke-kirurgiske alternativer.
The authors have nothing to disclose.
Den forskning, der blev rapporteret i denne publikation, blev støttet af Office of the Director, Office of Research Infrastructure Programs, fra National Institutes of Health under Award Number R43OD020304 og National Institute of Mental Health of the National Institutes of Health under Award Number R44MH122117. Indholdet er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter fra National Institutes of Health.
Blastocyst stage embryos | |||
CARD Fertiup Preincubation Medium (PM) | CosmoBio | KYD-002-EX | For sperm capacitation |
Embryo handling pipette | Cook Medical | K-FPIP-1120-10BS | Flexipet is available in various diameters |
Embryo handling pipette assembly | Paratechs | 90010 | |
Female mice, Crl:CD1(ICR) | Charles River Laboratories | 22 | >8 weeks old |
Forceps | Fine Science Tools | 11053-10 | Toothed, for dissection |
Forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | Curved, for dissection |
Forceps | Fine Science Tools | Dumont #5 | Fine, for dissection |
Hemocytometer | Fisher Scientific | 267110 | Optional |
human Chorionic Gonadotropin (hCG) | Prospec | hor-250 | For estrus synchronization |
Incubator, 37 °C 5% CO2 | Thermo Scientific | ||
Incubator, 37 °C, benchtop | Cook | K-MINC-1000 | |
Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | Absorbant tissues |
M2 medium | Millipore | MR-015-D | Embryo handling medium |
Male mice, Crl:CD1(ICR) | Charles River Laboratories | 22 | >8 weeks old |
mC&I device | ParaTechs | 60020 | For sperm transfer, specula included |
mCM rod | ParaTechs | 90050 | Smooth, blunt, with a diameter @3 mm |
Microscope | Olympus | SZX7 | 20x and 40x magnification with transmitted and reflected illumination source for embryo work and dissections |
Microscope | ACCU-SCOPE | 3032 | 100x magnification with bright field illumination |
Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
mNSET device | ParaTechs | 60010 | For embryo transfer, specula included |
Needles, 26 G | Exel | 26402 | |
Papanicolaou Staining System | VWR | 76265-730 | Optional |
Paraffin oil | Sigma-Aldrich | 18512 | |
Pipette, P200 | Corning | 4074 | Fits the C&I device for sperm transfer |
Pipette, PR-2 | Rainin | 17008648 | Fits the NSET device for embryo transfer |
Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG) | Prospec | hor-272 | For estrus synchronization |
Scale | American Weigh Scales | LB-1000 | |
Scissors | Fine Science Tools | 14068-12 | Dissection |
Scissors | Fine Science Tools | 14081-09 | Angled, dissection |
Swabs, Constix | Contec | SC-4 | For vaginal cytology |
Syringes, 1 cc | Becton Dickenson and Company | 309659 | |
Tissue culture dishes, 35 mm | Falcon | 353001 | |
Tissue culture dishes, 60 mm | Falcon | 353004 | |
Trimmer | Wahl | ChroMini T-Cut | |
Wire bar topped mouse cage |