Den cervikale manipulasjonsmetoden som presenteres, kan indusere pseudograviditet hos mus uten behov for avlshunner med vasektomerte hanner. Induksjon av pseudograviditet er nødvendig for å lykkes med ikke-kirurgisk embryooverføring og ikke-kirurgisk kunstig befruktning, som begge også presenteres.
For vellykket opprettholdelse av graviditet med embryooverføring eller kunstig befruktning, må kvinnelige mottakermus induseres til en pseudogravid tilstand. Hunnmus er tradisjonelt parret over natten med vasektomerte hanner, og neste morgen vurderes tilstedeværelsen av en kopulasjonsplugg. For å øke effektiviteten ved å produsere pseudogravide kvinner, har en cervical manipulasjonsteknikk blitt standardisert for å brukes i kombinasjon med ikke-kirurgisk embryooverføring eller kunstig inseminasjonsteknikker hos mus. Den stumpe enden av en liten plaststang settes inn vaginalt for å kontakte livmorhalsen og vibreres i 30 s ved kontakt med en trimmer. Prosedyren er rask og krever ikke anestesi eller smertestillende. Denne teknikken øker påliteligheten og forutsigbarheten av å produsere pseudopregnant kvinner og eliminerer helt kravet til vasektomerte menn. For CD1-mus var effektiviteten av pseudograviditetsinduksjon ved hjelp av cervikal manipulasjon 83 % for kvinner i østrus (N = 76), men bare 38 % av hunnene i østrus ble plugget av vasektomerte hanner (N = 24). Kunstig inseminasjon hos CD1-mus ble utført ved østrussynkronisering med hormoner, cervikal manipulasjon og livmoroverføring av sædceller. Mottakere av kunstig inseminasjon som fikk livmorhalsmanipulasjon (N = 76) hadde en drektighetsrate på 72 % og en gjennomsnittlig kullstørrelse på 8,3 avkom. Denne metoden kan også brukes til å produsere pseudogravide hunner for ikke-kirurgisk embryooverføring. Derfor er indusering av pseudograviditet ved cervikal manipulasjon et praktisk og effektivt alternativ til parring med en vasektomert mann når man utfører ikke-kirurgiske assisterte reproduksjonsteknikker. Bruk av cervikal manipulasjon gir 3Rs (erstatning, reduksjon og forfining) fordeler for assistert reproduksjonsteknikker ved å redusere antall dyr som kreves og eliminere nødvendigheten av kirurgisk endrede hanner.
Assistert reproduksjonsteknologi brukes til produksjon av genetisk modifiserte musemodeller, samt gjenoppretting av stammer fra kryopreservering, rederivatering av stammer fra en kompromittert helsestatus og strategisk vivariumstyring, inkludert produksjon av aldersmatchede kohorter. Alle teknikker for assistert befruktning hos mus krever bruk av pseudogravide kvinnelige mottakere for embryoutvikling. Historisk har pseudogravide mottakere blitt generert ved parring med sterile hanner, som enten er kirurgisk vasektomerte eller genetisk infertile, og tilstedeværelsen av en kopulasjonsplugg vurderes neste morgen1. Nylig har en protokoll for sonisk stimulering hos mus blitt utviklet for kirurgisk overføring av pronukleære eller tocellede museembryoer2. Vi har også utviklet en protokoll for cervixmanipulasjon (CM) for bruk ved kunstig befruktning og ikke-kirurgisk embryooverføring av blastocyster. Begrunnelsen for bruken av prosedyren er å gi en 3Rs reduksjon i antall dyr som kreves (ikke lenger krever hannmus) og en forbedring av teknikkene som brukes (ikke lenger nødvendiggjør kirurgisk vasektomi prosedyre for hannmus). Beskrivelsen av denne protokollen inkluderer tilhørende assistert befruktning teknikk for å hjelpe til med integrering av CM i normale arbeidsflyter. Det overordnede målet med CM-metoden er å erstatte bruken av hannmus i genereringen av pseudogravide hunner for assistert befruktning, inkludert kunstig befruktning og embryooverføring.
CM-protokollen beskrevet her ble først utviklet for å hjelpe til med kunstig befruktning hos mus. Den kunstige inseminasjonsprotokollen, som opprinnelig beskrevet, oppnådde en graviditetsrate på 50%, med en gjennomsnittlig kullstørrelse på 7 valper3. CD1-mottakermus var brunstsynkronisert med en lav dose hormoner, inkludert drektig mare serum gonadotropin (PMSG) og humant choriongonadotropin (hCG), med et 47 timers intervall før inseminasjon. En fordel med brunstsynkronisering var at det tillot bruk av protokollen i normal arbeidstid. Hunnene ble parret med vasektomerte hanner umiddelbart etter kunstig befruktning, og parring ble bekreftet ved tilstedeværelse av en kopieringsplugg. Inkonsistens i parringsraten med mottakere ble rapportert som en vanskelighet i prosedyren. Derfor ble det søkt alternativer til parring for induksjon av pseudograviditet.
Denne studien presenterer en standardisert CM-teknikk for å øke effektiviteten av å produsere pseudogravide kvinner. For kvinner i østrus eller proestrus settes den stumpe enden av en liten plaststang vaginalt inn for å kontakte livmorhalsen og vibreres i 30 s ved kontakt med en trimmer. Prosedyren utføres på et trådtoppet bur. Ingen anestesi eller smertestillende er nødvendig. CM-teknikken er praktisk for å produsere pseudopregnant kvinner, som kan produsere kull etter ikke-kirurgisk kunstig befruktning uten behov for parring med vasektomiserte hanner. CM kan også brukes til produksjon av pseudogravide hunner som mottakere av embryooverføring. Spesielt kan CM-teknikken kobles sammen med ikke-kirurgisk embryooverføring, som beskrevet her. Ikke-kirurgiske metoder har vist seg å være effektive for embryooverføring av blastocyststadiumembryoer hos mus 4,5og rotter 6,7. Siden denne ikke-kirurgiske metoden er et effektivt alternativ til kirurgiske metoder, regnes det som en 3Rs-forfining av teknikken. Basert på tidligere forskning indikerer fekale kortikosteronnivåer, som et mål på stress, at prosedyrens ikke-kirurgiske karakter ikke øker stressnivået hos gnagere 7,8. Prosedyrene er mindre teknisk utfordrende enn kirurgisk embryooverføring og er mye raskere å utføre. Etter hvert som embryoene overføres til livmoren, må embryoer av riktig stadium for livmorutvikling overføres. For mus overføres blastocystene til 2,5 dager etter coitum (dpc) pseudogravide mottakere.
For de to ikke-kirurgiske teknikkene som er beskrevet her, er tidspunktet for hormonadministrasjonen og CM-teknikken forskjellig. Tidspunktet for CM-prosedyren i forhold til østrus er viktig for suksess, da den erstatter naturlig parring for produksjon av pseudogravide mottakere. Ved å eliminere behovet for vasektomerte hanner for å indusere pseudograviditet, gir denne prosedyren 3Rs-fordeler ved både å redusere antall dyr som kreves og eliminere nødvendigheten av kirurgisk endrede hanner. Prosedyren i seg selv er rask (30 s) og krever ikke anestesi eller smertestillende. Teknikken øker i stor grad påliteligheten og forutsigbarheten ved å produsere pseudogravide kvinner for assistert befruktning.
3R-ene er et etisk rammeverk for dyrebruk i forskning, som beskrevet i 1959 av Russel og Burch i “The Principles of Humane Experimental Technique”15. 3R-ene representerer erstatning, reduksjon og foredling i bruk av dyr. Protokollene som er uthevet her er i samsvar med 3R-ene. Den cervikale manipulasjonsteknikken reduserer antall dyr som trengs ved ikke lenger å kreve bruk av menn for å produsere pseudopregnant kvinner. Teknikken eliminerer også behovet for å utføre vasektomi på hannene, og gir dermed raffinement ved å redusere smerte og nød. De assisterte befruktningsteknikkene som er beskrevet her (kunstig befruktning og embryooverføring) er ikke-kirurgiske, og gir dermed begge en 3Rs-forfining ved å redusere smerte og nød8forårsaket av deres kirurgiske alternativer.
Bruk av pseudopregnant kvinner er nødvendig for utvinning av valper når de utfører assistert reproduksjon hos mus1. CM-prosedyren er en effektiv metode for å produsere pseudogravide kvinner, men synkroniseringen av fasen av brunstsyklusen til mottakerhunnene er et kritisk første trinn i prosessen. Østralsynkronisering kan drastisk redusere antall hunner som trengs i kolonien for å forberede potensielle mottakere og hjelper til med å produsere tidsbestemte pseudogravide hunner på forespørsel. Bruk av en lav dose hormoner ser ikke ut til å forårsake noen skadelige effekter på utvinning av levende kull i CD1-mus. Det må utvises forsiktighet med andre stammer for å finne hormon- og konsentrasjonskombinasjonen som produserer mottakerhunnene av beste kvalitet for embryoene eller sæden som overføres. Synkronisering kan oppnås ved bruk av PMSG og hCG16, men doser som produserer superovulerte kvinner kan ikke være passende for en vedvarende graviditet17.
For å avgjøre om en kvinne er i østrus, ble det utført en cytologisk evaluering i dette arbeidet. Brunstfasen kan også evalueres ved observasjon av vaginalåpningen11,18. Selv om denne metoden er ekstremt nyttig og kan brukes alene eller som bekreftelse, er den mer subjektiv enn bruk av cytologi. Vaginal cytologi uten farging er både rask og effektiv for å velge kvinner i østrus fordi cornified epitelceller lett kan identifiseres. I denne protokollen utføres den cytologiske evalueringen før CM for å bestemme potensielle mottakere. Det er viktig å utføre cytologi før CM, da prosedyren har en tendens til å fragmentere cellene som er sloughed fra vaginalområdet, og dermed gjøre identifisering vanskelig. Cytologisk evaluering for pseudograviditet eller graviditet kan utføres 3,5-11,5 dager etter CM (dpcm) i 3 påfølgende dager. Profilen til en brunstsykling hunn bør ha minst 1 dag med betydelig infiltrasjon av cornified epitelceller. Pseudogravide / gravide kvinner bør vise en diestrusprofil (for det meste leukocytter med potensielt lave celletall) i 3 påfølgende dager.
Gjennom utviklingen av CM-teknikken ble noen mus funnet å være mer mottakelige for prosedyren enn andre. CD1-hunnmus er gode kandidater på grunn av deres rolige natur og gode pleieinstinkter. Denne belastningen er lett å håndtere og fungerer godt under CM og ikke-kirurgiske assistert reproduksjonsteknikker. C57Bl/6-mus har en tendens til å være mer aggressive og mindre pleiende. Selv om denne protokollen effektivt produserte pseudogravide C57Bl/6-kvinner ved bruk av CM, var det mindre sannsynlig at de konsekvent etterlot prosedyren. Dette syntes å korrelere noe med brunstfasen under CM. Kvinner i østrus eller proestrus var mer mottakelige. Bruken av et anrikningsrør for dyret å komme inn tillot tilgang til skjeden for prosedyren og bidro til å roe kvinnen. Prosedyren i seg selv begrenser ikke kvinnen fullt ut, slik at dyret kan trekke seg bort når som helst. Hvis dette skjer, kan dyret flyttes, og prosedyren kan deretter fortsette. Tidspunktet for prosedyren stopper hvis kvinnen går bort og gjenopptas når prosedyren gjenopptas. Kritisk for prosedyrens suksess er fasen av brunstsyklusen (sen proestrus og østrus) og kontakten av stangen med livmorhalsen. Trimmerens vibrasjon gir standardisert CM. For å sikre kontakt med livmorhalsen, påføres forsiktig trykk på stangen, og plasseringen av stangen mot livmorhalsen sikres med små frem og tilbake bevegelser av stangen.
Bruken av CM har forbedret NSAI-protokollen, da hunner i riktig fase av brunstsyklusen kan velges før sædoverføring, og protokollen er ikke lenger betinget av parring med vasektomerte hanner. Den kunstige brunstsyklussynkroniseringen er tidsbestemt slik at oocytmodning tilsvarer sædoverføring om morgenen på dag 4. Kritisk for protokollens suksess er tilpasningen av tidspunktet for eggløsning slik at befruktning kan oppstå. Det må utvises forsiktighet ved administrering av hCG 15-17 timer før forventet sædoverføring, som foreslått for tidspunktene som brukes til in vitro-fertilisering 1. Kvaliteten på sædprøven vil direkte påvirke utfallet av kunstig befruktning. Fersk sæd som har blitt kapasitert vil fungere best. Kryopreservert sæd av god kvalitet kan produsere befruktede embryoer in vivo. Imidlertid bør det utvises forsiktighet ved direkte overføring av tint sæd, da gjenværende kryobeskyttelsesmidler overført til livmorhornet kan hemme implantasjon (upubliserte observasjoner).
Bruken av CM i forbindelse med embryooverføring er konseptuelt en enkel tilpasning. Brunstsyklussynkronisering reduserer antall hunner som er nødvendig for å produsere mottakerutvalget. Bestemmelse av brunststadiet før CM øker sannsynligheten for å oppnå pseudogravide mottakere. En ulempe med metoden er at cytologien til mottakerne på tidspunktet for embryooverføring er i et stadium av fluss. Alle celletyper er tilstede hvis kvinnen overgår fra østrus til pseudograviditetsprofilen, og pseudograviditet blir bare tydelig hvis cytologien spores i flere dager. Basert på suksessen (>80%) av overgangen fra østrus til pseudograviditet for CD1- og C57Bl/6-mus, forventes denne metoden å være egnet for embryooverføringsmottakere. De foreløpige resultatene viser god suksess med begrenset ikke-kirurgisk embryooverføring. Generelt er effektiviteten av ikke-kirurgisk embryooverføring sammenlignbar med den for kirurgisk teknikk4,5, og ikke-kirurgisk overføring kan erstatte kirurgiske embryooverføringer på blastocyststadiet. For embryoer i tidligere stadier er embryokultur til blastocyststadiet nødvendig. Men hvis en kirurgisk overføring foretrekkes, er det mulig å tilpasse CM-teknikken til riktig timing som trengs for passende pseudogravide mottakere2. Generelt er embryomottakerne 1 dag mindre avanserte enn embryoet. For eksempel høstes blastocystene ved 3,5 dpc fra givere og overføres til 2,5 dpc-mottakere. Derfor må CM utføres slik at mottakeren er i en mindre utviklet pseudogravid tilstand enn embryoene.
Avslutningsvis viser CM-teknikken som er skissert her, utmerket løfte om integrering med andre assisterte reproduksjonsteknikker for mus. Vi har gitt vellykkede protokoller for kunstig inseminasjon og embryooverføring ved hjelp av ikke-kirurgiske teknikker. I kombinasjon gir CM-teknikken 3Rs-fordeler, inkludert (1) en reduksjon i antall dyr ved å eliminere behovet for vasektomerte hanner og (2) en forbedring av teknikker ved å erstatte kirurgiske teknikker med ikke-kirurgiske alternativer.
The authors have nothing to disclose.
Forskningen rapportert i denne publikasjonen ble støttet av kontoret til direktøren, Office of Research Infrastructure Programs, av National Institutes of Health under Award Number R43OD020304 og National Institute of Mental Health av National Institutes of Health under Award Number R44MH122117. Innholdet er utelukkende forfatternes ansvar og representerer ikke nødvendigvis de offisielle synspunktene til National Institutes of Health.
Blastocyst stage embryos | |||
CARD Fertiup Preincubation Medium (PM) | CosmoBio | KYD-002-EX | For sperm capacitation |
Embryo handling pipette | Cook Medical | K-FPIP-1120-10BS | Flexipet is available in various diameters |
Embryo handling pipette assembly | Paratechs | 90010 | |
Female mice, Crl:CD1(ICR) | Charles River Laboratories | 22 | >8 weeks old |
Forceps | Fine Science Tools | 11053-10 | Toothed, for dissection |
Forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | Curved, for dissection |
Forceps | Fine Science Tools | Dumont #5 | Fine, for dissection |
Hemocytometer | Fisher Scientific | 267110 | Optional |
human Chorionic Gonadotropin (hCG) | Prospec | hor-250 | For estrus synchronization |
Incubator, 37 °C 5% CO2 | Thermo Scientific | ||
Incubator, 37 °C, benchtop | Cook | K-MINC-1000 | |
Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | Absorbant tissues |
M2 medium | Millipore | MR-015-D | Embryo handling medium |
Male mice, Crl:CD1(ICR) | Charles River Laboratories | 22 | >8 weeks old |
mC&I device | ParaTechs | 60020 | For sperm transfer, specula included |
mCM rod | ParaTechs | 90050 | Smooth, blunt, with a diameter @3 mm |
Microscope | Olympus | SZX7 | 20x and 40x magnification with transmitted and reflected illumination source for embryo work and dissections |
Microscope | ACCU-SCOPE | 3032 | 100x magnification with bright field illumination |
Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
mNSET device | ParaTechs | 60010 | For embryo transfer, specula included |
Needles, 26 G | Exel | 26402 | |
Papanicolaou Staining System | VWR | 76265-730 | Optional |
Paraffin oil | Sigma-Aldrich | 18512 | |
Pipette, P200 | Corning | 4074 | Fits the C&I device for sperm transfer |
Pipette, PR-2 | Rainin | 17008648 | Fits the NSET device for embryo transfer |
Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG) | Prospec | hor-272 | For estrus synchronization |
Scale | American Weigh Scales | LB-1000 | |
Scissors | Fine Science Tools | 14068-12 | Dissection |
Scissors | Fine Science Tools | 14081-09 | Angled, dissection |
Swabs, Constix | Contec | SC-4 | For vaginal cytology |
Syringes, 1 cc | Becton Dickenson and Company | 309659 | |
Tissue culture dishes, 35 mm | Falcon | 353001 | |
Tissue culture dishes, 60 mm | Falcon | 353004 | |
Trimmer | Wahl | ChroMini T-Cut | |
Wire bar topped mouse cage |