एक ऑप्टिकल घनत्व-आधारित माइक्रोप्लेट विधि को बैक्टीरियोफेज की उपस्थिति में दीर्घकालिक जीवाणु विकास को मापने के लिए वर्णित किया गया है, जो एक्टिनोमाइसेट्स और अन्य धीमी गति से बढ़ने वाले बैक्टीरिया के लिए उपयुक्त है। इस विधि में वाष्पीकरण और ढक्कन संघनन को कम करने के लिए संशोधन और वायरस संक्रमण मैट्रिक्स की गणना करने के लिए आर कोड शामिल है, जिसमें वक्र के नीचे का क्षेत्र, विकास अधिकतम और सापेक्ष विषाणु शामिल हैं।
बैक्टीरियोफेज प्राकृतिक वातावरण का एक महत्वपूर्ण हिस्सा हैं, और उनके पास बैक्टीरिया की आबादी को आकार देने की एक शक्तिशाली क्षमता है। यह समझने के लिए कि व्यक्तिगत फेज एक्टिनोमाइसेट्स जैसे धीमी गति से बढ़ने वाले जीवाणु मेजबानों के साथ कैसे बातचीत करते हैं, फेज की उपस्थिति में दीर्घकालिक जीवाणु विकास को निर्धारित करने के लिए एक आसान और विश्वसनीय विधि की आवश्यकता होती है। स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक माइक्रोप्लेट रीडर उच्च-थ्रूपुट बार-बार माप की अनुमति देते हैं, लेकिन विस्तारित समय के लिए एक छोटी मात्रा को इनक्यूबेट करना तकनीकी चुनौतियां पेश कर सकता है। यह प्रक्रिया 96 घंटे के लिए उप-नमूनाकरण के बिना फेज और बैक्टीरिया के सह-संवर्धन की अनुमति देने के लिए एक मानक 96-वेल माइक्रोप्लेट को अनुकूलित करती है, जिसमें स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक अवशोषण मूल्यों का उपयोग करके हर 8 घंटे में बैक्टीरिया की वृद्धि दर्ज की जाती है। इन ऑप्टिकल घनत्व मूल्यों का विश्लेषण संक्रमण मैट्रिक्स उत्पन्न करने के लिए आर का उपयोग करके किया जाता है, जिसमें प्रतिशत वृद्धि अवरोध, सापेक्ष विषाणु और स्टेसी-सेबालोस सूचकांक शामिल हैं। यहां उल्लिखित विधियां विस्तारित अवधि के माइक्रोप्लेट विकास वक्र प्रयोगों का संचालन और विश्लेषण करने का एक प्रभावी तरीका प्रदान करती हैं और इसमें वाष्पीकरण और ढक्कन संघनन को कम करने के लिए संशोधन शामिल हैं। ये प्रोटोकॉल धीमी गति से बढ़ने वाले जीवाणु मेजबानों और उनके बैक्टीरियोफेज के बीच बातचीत के माइक्रोप्लेट-आधारित परख की सुविधा प्रदान करते हैं।
बैक्टीरियोफेज या फेज वायरस हैं जो बैक्टीरिया को संक्रमित करते हैं। वे ग्रह1 पर सबसे अधिक जैविक संस्थाएं हैं, और यह आमतौर पर स्वीकार किया जाता है कि बैक्टीरियोफेज बैक्टीरिया के विकास और पारिस्थितिकी तंत्र प्रक्रियाओं को प्रभावित करते हैं 2,3,4. बैक्टीरियोफेज होस्ट रेंज 8 और संक्रमण गतिशीलता5,6 का वर्णन, माप और विश्लेषण करने के लिए कई विधियां मौजूद हैं, जिनमें आगर-आधारित विधियां जैसे डबल-लेयर एगर विधि7 और ऑप्टिकल घनत्व-आधारित माइक्रोप्लेट विधियां 8,9,10,11,12 शामिल हैं।. प्रत्येक विधि के अपने फायदे और नुकसान हैं। उनकी दक्षता के कारण, डबल-लेयर एगर विधि का उपयोग करके चढ़ाना परीक्षण मेजबान रेंज परख के लिए “स्वर्ण मानक” हैं, लेकिन यह विधि समय- और श्रम-गहन9 है। रैपिड माइक्रोप्लेट विधियां, जो 24 घंटे या उससे कम समय में परिणाम देती हैं, तेजी से बढ़ते जीवाणु मेजबानों जैसे एस्चेरिचिया कोलाई 9,10,11,12 के लिए उत्कृष्ट परिणाम देती हैं, लेकिन एक्टिनोमाइसेट्स7,13,14,15 जैसे धीमी गति से बढ़ने वाले जीवाणु मेजबानों में बैक्टीरियोफेज संक्रमण की प्रगति को प्रदर्शित करने के लिए बहुत संक्षिप्त हैं।
तेजी से बढ़ते बैक्टीरिया के लिए डिज़ाइन किए गए एक ऑप्टिकल घनत्व-आधारित माइक्रोप्लेट परख को वाष्पीकरण के बिना धीमी गति से बढ़ने वाले मेजबान जीवाणु में संक्रमण की गतिशीलता को चिह्नित करने के लिए आवश्यक कई दिनों तक नहीं चलाया जा सकता है और कृत्रिम रूप से उच्च जीवाणु घनत्व देता है। इस प्रकार, धीमी गति से बढ़ने वाली जीवाणु प्रजातियों के लिए बैक्टीरियोफेज संक्रमण गतिशीलता पर तुलनीय उच्च-थ्रूपुट डेटा प्राप्त करने के लिए इन बैक्टीरिया के लिए अनुकूलित विशेष तकनीकों की आवश्यकता होती है।
यहां प्रस्तुत माइक्रोप्लेट विधि वाष्पीकरण को कम करती है, इस प्रकार धीमी गति से बढ़ने वाले बैक्टीरिया को एक विस्तारित 96 घंटे की अवधि के लिए फेज के साथ सह-सुसंस्कृत करने की अनुमति देती है और फेज संक्रमण गतिशीलता और मेजबान सीमा में जांच को सक्षम करती है। यह विधि स्टेसी-सेबालोस इंडेक्स16 को भी प्रदर्शित करती है, एक ऑप्टिकल घनत्व-आधारित मीट्रिक जो असमान मेजबान-वायरस प्रणालियों के बीच विषाणु तुलना की अनुमति देता है।
यह ऑप्टिकल घनत्व-आधारित माइक्रोप्लेट विधि बैक्टीरियोफेज होस्ट रेंज और संक्रमण गतिशीलता11 में जांच की अनुमति देती है और बैक्टीरियोफेज विषाणु के माप के रूप में स्टेसी-सेबालोस इंडेक्स16 की उपयोगिता दिखाती है। हालांकि इस विधि का उपयोग किसी भी बैक्टीरियोफेज-होस्ट सिस्टम के साथ किया जा सकता है, लेकिन इसे विशेष रूप से एक्टिनोमाइसेट्स जैसे धीमी गति से बढ़ने वाले बैक्टीरिया के साथ उपयोग के लिए तेजी से माइक्रोप्लेट विकास परख 9,10,11 को अनुकूलित करने के लिए डिज़ाइन किया गया था। वाष्पीकरण और ढक्कन संघनन को संबोधित करने के लिए संशोधनों के बिना धीमी गति से बढ़ने वाले बैक्टीरिया के लिए रैपिड माइक्रोप्लेट परख का उपयोग नहीं किया जा सकता है। यह विधि इन आवश्यक संशोधनों का वर्णन करती है और पहली बार, बैक्टीरियोफेज संक्रमण का वर्णन करने के लिए स्टेसी-सेबालोस इंडेक्स और संबंधित मैट्रिक्स16 का उपयोग दर्शाती है।
वाष्पीकरण बहु-दिवसीय 96-वेल प्लेट विकास वक्र परख में एक महत्वपूर्ण चुनौती हो सकती है; यह विधि सीमा कुओं और कुओं के बीच रिक्त स्थान में अगारोस जोड़कर उस समस्या को हल करती है। अगारोस मार्जिन, एंटी-फॉग ढक्कन उपचार22 के साथ संयुक्त, माइक्रोप्लेट के भीतर आवश्यक आर्द्रता प्रदान करता है और विश्वसनीय ऑप्टिकल घनत्व माप की अनुमति देता है। अतिरिक्त आर्द्रता के बिना, आवश्यक लंबी इनक्यूबेशन अवधिके दौरान पर्याप्त किनारे प्रभाव वाष्पीकरण होता है, जिससे कृत्रिम रूप से उच्च ऑप्टिकल घनत्व रीडिंग होती है। एंटी-फॉग ढक्कन उपचार एक आवश्यक संशोधन है क्योंकि ढक्कन संघनन कृत्रिम रूप से ऑप्टिकल घनत्व मूल्यों को भी बढ़ा सकता है। इनक्यूबेशन अवधि के दौरान प्लेटों को हिलाना एक अनुशंसित संशोधन है, क्योंकि एक्टिनोमाइसेट बैक्टीरिया विकास के दौरान टकरा सकते हैं, कृत्रिम रूप से उच्च ऑप्टिकल घनत्व मान दे सकते हैं और संक्रमण की बहुलता को प्रभावी ढंग से कम कर सकते हैं।
संक्रमण की गतिशीलता को दर्शाने वाले प्रयोगों में बैक्टीरिया से फेज का अनुपात महत्वपूर्ण है, क्योंकि संक्रमण प्रभाव दिखाने के लिए पर्याप्त फेज होना चाहिए, लेकिन इतने अधिक नहीं कि मेजबान बैक्टीरिया की आबादी तुरंत9 दुर्घटनाग्रस्त हो जाए या लाइसोजेनी की आवृत्ति नाटकीय रूपसे बढ़ जाए। इस पद्धति में, लगातार परिणाम प्राप्त करने के लिए सबसे प्रभावी पाया गया अनुपात 1 का एमओआई था, लेकिन 0.1 और 0.01 के एमओआई के साथ उपयोग करने योग्य परिणाम भी प्राप्त किए गए थे। इस विधि को लागू करते समय, बैक्टीरिया की एक एकाग्रता चुनने और 0.01-1 9,10,11 की एमओआई रेंज में कई फेज सांद्रता का परीक्षण करने की सिफारिश की जाती है।
यहां वर्णित यह तकनीक बैक्टीरियोफेज-होस्ट इंटरैक्शन को प्रत्येक माप अंतराल29 पर एक बड़े कल्चर फ्लास्क से उप-नमूने के बजाय उच्च-थ्रूपुट माइक्रोप्लेट परख में धीमी गति से बढ़ने वाले बैक्टीरिया के लिए मूल्यांकन करने की अनुमति देती है। इसके अलावा, यह प्रदर्शित करके कि माइक्रोप्लेट विकास परख 9,10,11 को कैसे अनुकूलित किया जा सकता है, यह तकनीक धीमी गति से बढ़ने वाले बैक्टीरिया के लिए अन्य माइक्रोप्लेट-आधारित बैक्टीरियोफेज परख की उपयोगिता को बढ़ाती है, जिसमें फेज लक्षण वर्णन 5,6,12 और विकास अध्ययन30,31 शामिल हैं। अंत में, यह विधि बैक्टीरियोफेज संक्रमण का वर्णन करने के लिए स्टेसी-सेबालोस इंडेक्स16 के उपयोग को प्रदर्शित करती है। इस मीट्रिक को शुरू में एक आर्कियल वायरस मॉडल सिस्टम से डेटा के साथ विकसित किया गया था और इसकी गणना ऑप्टिकल घनत्व मूल्यों से की जाती है, इस प्रकार इसे असमान वायरस सिस्टम में व्यापक उपयोगिता मिलती है।
The authors have nothing to disclose.
इस काम को एनएसएफ डीबीआई जीवविज्ञान एकीकरण संस्थान (बीआईआई) अनुदान (पुरस्कार संख्या 2119968; पीआई-सेबलोस) और अर्कांसस आईएनबीआरई कार्यक्रम द्वारा, नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ जनरल मेडिकल साइंसेज, (एनआईजीएमएस), पी 20 GM103429 नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ से अनुदान के साथ। लेखक ों ने औचिता बैपटिस्ट विश्वविद्यालय में पैटरसन समर अंडरग्रेजुएट रिसर्च प्रोग्राम के समर्थन की भी सराहना की।
Agarose | Omni-Pur | 2090 | for filling border wells of microplate |
Costar 96 Well Lid Low Evaporation Corner Notch | Corning | 3931 | replacement microplate lid |
Isopropanol | Fisher Chemical | A461-4 | for lid coating |
Microplate reader | Tecan Spark 20M | ||
Microplate Shaker with 4-Place Platform | Thermo Fisher Scientific | 88-861-023 | to shake plates during incubation |
Non-Tissue Culture-Treated Plate 96 well | Falcon (a Corning Brand) | 351172 | microplate for growth curve assay |
Peptone yeast calcium (PYCa) agar | Homemade | 1 g peptone 15 g yeast extract 15 g agar 990 mL dd H2O 4.5 mL 1 M CaCl2 2.5 mL 40% dextrose 1 mL 10 mg/mL cycloheximide |
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Peptone yeast calcium (PYCa) broth | Homemade, from Reference 16 | 1 g peptone 15 g yeast extract 990 mL dd H2O 4.5 ml 1 M CaCl2 2.5 mL 40% dextrose 1 mL 10 mg/mL cycloheximide |
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Peptone yeast calcium (PYCa) top agar | Homemade | 1 g peptone 15 g yeast extract 4 g agar 990 mL dd H2O 4.5 mL 1M CaCl2 2.5 mL 40% dextrose |
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Petri plates | Thermo Fisher Scientific | FB0875713 | for determination of bacterial concentration and phage titer assay |
Phage Buffer | Homemade, from Reference 7 | 10 mL 1 M Tris, pH 7.5 10 mL 1 M MgSO4 4 g NaCl 980 ml dd H2O |
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R software | https://www.r-project.org/ | version 4.3.0 | |
Sterile Disposable PETG Flask Baffled Bottom w/Vented Closure | Thermo Fisher Scientific | 4116-1000 | for bacterial culture |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | 9036-19-5 | for lid coating |