En optisk tetthetsbasert mikroplatemetode er beskrevet for å kvantifisere langsiktig bakterievekst i nærvær av bakteriofager, egnet for actinomyceter og andre saktevoksende bakterier. Denne metoden inkluderer modifikasjoner for å redusere fordampning og lokkkondensasjon og R-kode for å beregne virusinfeksjonsberegninger, inkludert området under kurven, vekstmaksimum og relativ virulens.
Bakteriofager er en viktig del av naturlige miljøer, og de har en kraftig evne til å forme bakteriepopulasjoner. For å forstå hvordan individuelle fager samhandler med langsomt voksende bakterielle verter som actinomycetes, er det nødvendig med en enkel og pålitelig metode for å kvantifisere langsiktig bakterievekst i nærvær av fager. Spektrofotometriske mikroplatelesere tillater gjentatte målinger med høy gjennomstrømning, men inkubering av et lite volum i lengre tid kan by på tekniske utfordringer. Denne prosedyren tilpasser en standard 96-brønns mikroplate for å tillate samdyrking av fager og bakterier uten sub-prøvetaking i 96 timer, med bakterieveksten registrert hver 8. time ved hjelp av spektrofotometriske absorbansverdier. Disse optiske tetthetsverdiene analyseres ved hjelp av R for å gi infeksjonsberegninger, inkludert prosentvis veksthemming, relativ virulens og Stacy-Ceballos-indeksen. Metodene som er skissert her, gir en effektiv måte å gjennomføre og analysere eksperimenter med mikroplatevekstkurve med lengre varighet og inkluderer modifikasjoner for å redusere fordampning og lokkkondensering. Disse protokollene letter mikroplatebaserte analyser av interaksjoner mellom langsomt voksende bakterielle verter og deres bakteriofager.
Bakteriofager eller fager er virus som infiserer bakterier. De er de mest tallrike biologiske enhetene på planeten1, og det er generelt akseptert at bakteriofager påvirker bakteriell evolusjon og økosystemprosesser 2,3,4. Det finnes flere metoder for å beskrive, måle og analysere bakteriofagvertsområde 8 og infeksjonsdynamikk5,6, inkludert agarbaserte metoder som dobbeltlags agarmetode7 og optisk tetthetsbaserte mikroplatemetoder8,9,10,11,12. Hver metode har sine egne fordeler og ulemper. På grunn av deres effektivitet er pletteringstester ved bruk av dobbeltlags agarmetoden “gullstandarden” for vertsområdeanalyser, men denne metoden er tids- og arbeidskrevende9. Raske mikroplatemetoder, som returnerer resulterer i 24 timer eller mindre, gir gode resultater for raskt voksende bakterielle verter som Escherichia coli 9,10,11,12, men er for korte til å vise bakteriofaginfeksjonsprogresjon i langsommere voksende bakterielle verter som actinomycetes7,13,14,15.
En optisk tetthetsbasert mikroplateanalyse designet for raskt voksende bakterier kan ikke kjøres i flere dager som kreves for å karakterisere infeksjonsdynamikk i en sakte voksende vertsbakterie uten at fordampning forekommer og gir kunstig høy bakterietetthet. Dermed krever innhenting av sammenlignbare data med høy gjennomstrømning om bakteriofaginfeksjonsdynamikk for saktevoksende bakteriearter spesialiserte teknikker tilpasset disse bakteriene.
Mikroplatemetoden som presenteres her reduserer fordampning, slik at saktevoksende bakterier kan dyrkes sammen med en i en lengre periode på 96 timer og muliggjør undersøkelser av faginfeksjonsdynamikk og vertsområde. Denne metoden viser også Stacy-Ceballos-indeksen16, en optisk tetthetsbasert beregning som muliggjør virulenssammenligninger mellom forskjellige vertsvirussystemer.
Denne optiske tetthetsbaserte mikroplatemetoden tillater undersøkelse av bakteriofagvertsområde og infeksjonsdynamikk11 og viser nytten av Stacy-Ceballos-indeksen16 som et mål på bakteriofagvirulens. Selv om denne metoden kan brukes med et hvilket som helst bakteriofag-vertssystem, ble den designet spesielt for å tilpasse raske mikroplatevekstanalyser 9,10,11 for bruk med langsommere voksende bakterier som actinomycetes. Raske mikroplateanalyser kan ikke brukes til saktevoksende bakterier uten modifikasjoner for å adressere fordampning og lokkkondensering. Denne metoden beskriver disse nødvendige modifikasjonene og demonstrerer for første gang bruken av Stacy-Ceballos-indeksen og relaterte beregninger16 for å beskrive bakteriofaginfeksjon.
Fordampning kan være en betydelig utfordring i flerdagers 96-brønns platevekstkurveanalyser; Denne metoden løser dette problemet ved å legge agarose til grensebrønnene og mellomrommene mellom brønnene. Agarosemarginen, kombinert med antidugglokkbehandling22, gir den nødvendige fuktigheten i mikroplaten og muliggjør pålitelige optiske tetthetsmålinger. Uten den ekstra fuktigheten oppstår betydelig kanteffektfordampning23 i løpet av den lange inkubasjonsperioden som kreves, noe som fører til kunstig høye optiske tetthetsavlesninger. Antidugglokkbehandlingen er en nødvendig modifikasjon fordi lokkkondensering også kunstig kan heve de optiske tetthetsverdiene. Risting av platene i inkubasjonsperioden er en anbefalt modifikasjon, da actinomycete-bakterier kan klumpe seg under vekst, noe som gir kunstig høye optiske tetthetsverdier og effektivt reduserer infeksjonsmangfoldet.
Forholdet mellom bakterier og i eksperimenter som karakteriserer infeksjonsdynamikk er kritisk, da det må være nok til å vise en infeksjonseffekt, men ikke så mange at vertsbakteriepopulasjonen umiddelbart krasjer9 eller frekvensen av lysogeni økes dramatisk28. I denne metoden var forholdet som ble funnet å være mest effektivt for å oppnå konsistente resultater en MOI på 1, men brukbare resultater ble også oppnådd med MOI på 0,1 og 0,01. Ved implementering av denne metoden anbefales det å velge en konsentrasjon av bakterier og teste flere fagkonsentrasjoner i MOI-området 0,01-1 9,10,11.
Denne teknikken beskrevet her gjør det mulig å vurdere bakteriofag-vert-interaksjoner for langsomt voksende bakterier i mikroplateanalyser med høy gjennomstrømning i stedet for med delprøvetaking fra en større kulturkolbe ved hvert måleintervall29. Videre, ved å demonstrere hvordan mikroplatevekstanalyser 9,10,11 kan tilpasses, øker denne teknikken nytten av andre mikroplatebaserte bakteriofaganalyser for langsommere voksende bakterier, inkludert fagkarakterisering5,6,12 og evolusjonsstudier 30,31. Endelig demonstrerer denne metoden bruken av Stacy-Ceballos-indeksen16 for å beskrive bakteriofaginfeksjon. Denne beregningen ble opprinnelig utviklet med data fra et arkeisk virusmodellsystem og beregnes ut fra optiske tetthetsverdier, noe som gir den utbredt nytte på tvers av forskjellige virussystemer.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av et NSF DBI Biology Integration Institute (BII) stipend (pris nr. 2119968; PI-Ceballos) og ved Arkansas INBRE-programmet, med tilskudd fra National Institute of General Medical Sciences, (NIGMS), P20 GM103429 fra National Institutes of Health. Forfatterne setter også pris på støtten fra Patterson Summer Undergraduate Research Program ved Ouachita Baptist University.
Agarose | Omni-Pur | 2090 | for filling border wells of microplate |
Costar 96 Well Lid Low Evaporation Corner Notch | Corning | 3931 | replacement microplate lid |
Isopropanol | Fisher Chemical | A461-4 | for lid coating |
Microplate reader | Tecan Spark 20M | ||
Microplate Shaker with 4-Place Platform | Thermo Fisher Scientific | 88-861-023 | to shake plates during incubation |
Non-Tissue Culture-Treated Plate 96 well | Falcon (a Corning Brand) | 351172 | microplate for growth curve assay |
Peptone yeast calcium (PYCa) agar | Homemade | 1 g peptone 15 g yeast extract 15 g agar 990 mL dd H2O 4.5 mL 1 M CaCl2 2.5 mL 40% dextrose 1 mL 10 mg/mL cycloheximide |
|
Peptone yeast calcium (PYCa) broth | Homemade, from Reference 16 | 1 g peptone 15 g yeast extract 990 mL dd H2O 4.5 ml 1 M CaCl2 2.5 mL 40% dextrose 1 mL 10 mg/mL cycloheximide |
|
Peptone yeast calcium (PYCa) top agar | Homemade | 1 g peptone 15 g yeast extract 4 g agar 990 mL dd H2O 4.5 mL 1M CaCl2 2.5 mL 40% dextrose |
|
Petri plates | Thermo Fisher Scientific | FB0875713 | for determination of bacterial concentration and phage titer assay |
Phage Buffer | Homemade, from Reference 7 | 10 mL 1 M Tris, pH 7.5 10 mL 1 M MgSO4 4 g NaCl 980 ml dd H2O |
|
R software | https://www.r-project.org/ | version 4.3.0 | |
Sterile Disposable PETG Flask Baffled Bottom w/Vented Closure | Thermo Fisher Scientific | 4116-1000 | for bacterial culture |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | 9036-19-5 | for lid coating |