En optisk densitetsbaserad mikroplattmetod beskrivs för att kvantifiera långsiktig bakterietillväxt i närvaro av bakteriofager, lämpliga för aktinomyceter och andra långsamt växande bakterier. Denna metod inkluderar modifieringar för att minska avdunstning och lockkondensation och R-kod för att beräkna virusinfektionsmått, inklusive arean under kurvan, tillväxtmaximum och relativ virulens.
Bakteriofager är en viktig del av naturliga miljöer, och de har en kraftfull förmåga att forma bakteriepopulationer. För att förstå hur enskilda fager interagerar med långsamt växande bakterievärdar som aktinomyceter behövs en enkel och pålitlig metod för att kvantifiera långsiktig bakterietillväxt i närvaro av fager. Spektrofotometriska mikroplattläsare möjliggör upprepade mätningar med hög genomströmning, men inkubation av en liten volym under en längre tid kan ge tekniska utmaningar. Denna procedur anpassar en standard 96-brunns mikroplatta för att möjliggöra samodling av fager och bakterier utan delprovtagning i 96 timmar, med bakterietillväxten registrerad var 8: e timme med spektrofotometriska absorbansvärden. Dessa optiska densitetsvärden analyseras med R för att ge infektionsmått, inklusive procentuell tillväxthämning, relativ virulens och Stacy-Ceballos-indexet. Metoderna som beskrivs här ger ett effektivt sätt att genomföra och analysera experiment med mikroplattans tillväxtkurva med förlängd varaktighet och inkluderar modifieringar för att minska avdunstning och lockkondensation. Dessa protokoll underlättar mikroplattbaserade analyser av interaktioner mellan långsamt växande bakterievärdar och deras bakteriofager.
Bakteriofager eller fager är virus som infekterar bakterier. De är de mest talrika biologiska enheterna på planeten1, och det är allmänt accepterat att bakteriofager påverkar bakteriell utveckling och ekosystemprocesser 2,3,4. Flera metoder finns för att beskriva, mäta och analysera bakteriofagvärdområde 8 och infektionsdynamik5,6, inklusive agarbaserade metoder såsom dubbelskiktagarmetoden7 och optiska densitetsbaserade mikroplattmetoder8,9,10,11,12. Varje metod har sina egna fördelar och nackdelar. På grund av deras effektivitet är pläteringstester med dubbelskiktagarmetoden “guldstandarden” för värdområdesanalyser, men denna metod är tids- och arbetsintensiv9. Snabba mikroplattmetoder, som returnerar resultat inom 24 timmar eller mindre, ger utmärkta resultat för snabbväxande bakterievärdar som Escherichia coli 9,10,11,12 men är för korta för att visa bakteriofaginfektionsprogression i långsammare växande bakterievärdar som aktinomyceter7,13,14,15.
En optisk densitetsbaserad mikroplattanalys utformad för snabbväxande bakterier kan inte köras under de flera dagar som krävs för att karakterisera infektionsdynamiken i en långsamt växande värdbakterie utan att avdunstning inträffar och ger artificiellt höga bakterietätheter. För att erhålla jämförbara data med hög genomströmning om bakteriofaginfektionsdynamik för långsamt växande bakteriearter krävs således specialiserade tekniker anpassade för dessa bakterier.
Mikroplattmetoden som presenteras här minskar avdunstningen, vilket gör att långsamt växande bakterier kan samodlas med en under en förlängd 96-timmarsperiod och möjliggöra undersökningar av faginfektionsdynamik och värdområde. Denna metod visar också Stacy-Ceballos index16, ett optiskt densitetsbaserat mått som möjliggör virulensjämförelser mellan olika värdvirussystem.
Denna optiska densitetsbaserade mikroplattmetod möjliggör undersökning av bakteriofagvärdområde och infektionsdynamik11 och visar användbarheten av Stacy-Ceballos index16 som ett mått på bakteriofagvirulens. Även om denna metod kan användas med vilket bakteriofagvärdsystem som helst, utformades den speciellt för att anpassa snabba mikroplatttillväxtanalyser 9,10,11 för användning med långsammare växande bakterier såsom aktinomyceter. Snabba mikroplattanalyser kan inte användas för långsamt växande bakterier utan modifieringar för att hantera avdunstning och lockkondensation. Denna metod beskriver dessa nödvändiga modifieringar och demonstrerar för första gången användningen av Stacy-Ceballos-indexet och relaterade mätvärden16 för att beskriva bakteriofaginfektion.
Avdunstning kan vara en betydande utmaning i flerdagars 96-brunns platttillväxtkurvanalyser; Denna metod löser det problemet genom att lägga till agaros till gränsbrunnarna och utrymmena mellan brunnarna. Agarosmarginalen, i kombination med imskyddslockets behandling22, ger den nödvändiga fuktigheten i mikroplattan och möjliggör tillförlitliga optiska densitetsmätningar. Utan den extra fuktigheten sker betydande kanteffektavdunstning23 under den långa inkubationsperiod som krävs, vilket leder till artificiellt höga optiska densitetsavläsningar. Anti-dimma lockbehandling är en nödvändig modifiering eftersom lockkondensation också artificiellt kan höja de optiska densitetsvärdena. Att skaka plattorna under inkubationsperioden är en rekommenderad modifiering, eftersom aktinomycetebakterier kan klumpa sig under tillväxt, vilket ger artificiellt höga optiska densitetsvärden och effektivt minskar infektionsmångfalden.
Förhållandet mellan bakterier och i experiment som karakteriserar infektionsdynamik är kritiskt, eftersom det måste finnas tillräckligt med för att visa en infektionseffekt men inte så många att värdbakteriepopulationen omedelbart kraschar9 eller frekvensen av lysogeni ökar dramatiskt28. I denna metod var det förhållande som befanns vara mest effektivt för att erhålla konsekventa resultat en MOI på 1, men användbara resultat erhölls också med MOI på 0,1 och 0,01. Vid implementering av denna metod rekommenderas att välja en koncentration av bakterier och testa flera fagkoncentrationer i MOI-intervallet 0,01-1 9,10,11.
Denna teknik som beskrivs här gör det möjligt att bedöma bakteriofag-värdinteraktioner för långsamt växande bakterier i mikroplattanalyser med hög kapacitet snarare än med delprovtagning från en större odlingskolv vid varje mätintervall29. Vidare, genom att visa hur mikroplatttillväxtanalyser 9,10,11 kan anpassas, ökar denna teknik användbarheten av andra mikroplattbaserade bakteriofaganalyser för långsammare växande bakterier, inklusive fagkarakterisering5,6,12 och evolutionsstudier 30,31. Slutligen demonstrerar denna metod användningen av Stacy-Ceballos index16 för att beskriva bakteriofaginfektion. Detta mått utvecklades ursprungligen med data från ett arkealt virusmodellsystem och beräknas från optiska densitetsvärden, vilket ger det utbredd användbarhet över olika virussystem.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av ett NSF DBI Biology Integration Institute (BII) bidrag (pris nr 2119968; PI-Ceballos) och av Arkansas INBRE-programmet, med bidrag från National Institute of General Medical Sciences, (NIGMS), P20 GM103429 från National Institutes of Health. Författarna uppskattar också stödet från Patterson Summer Undergraduate Research Program vid Ouachita Baptist University.
Agarose | Omni-Pur | 2090 | for filling border wells of microplate |
Costar 96 Well Lid Low Evaporation Corner Notch | Corning | 3931 | replacement microplate lid |
Isopropanol | Fisher Chemical | A461-4 | for lid coating |
Microplate reader | Tecan Spark 20M | ||
Microplate Shaker with 4-Place Platform | Thermo Fisher Scientific | 88-861-023 | to shake plates during incubation |
Non-Tissue Culture-Treated Plate 96 well | Falcon (a Corning Brand) | 351172 | microplate for growth curve assay |
Peptone yeast calcium (PYCa) agar | Homemade | 1 g peptone 15 g yeast extract 15 g agar 990 mL dd H2O 4.5 mL 1 M CaCl2 2.5 mL 40% dextrose 1 mL 10 mg/mL cycloheximide |
|
Peptone yeast calcium (PYCa) broth | Homemade, from Reference 16 | 1 g peptone 15 g yeast extract 990 mL dd H2O 4.5 ml 1 M CaCl2 2.5 mL 40% dextrose 1 mL 10 mg/mL cycloheximide |
|
Peptone yeast calcium (PYCa) top agar | Homemade | 1 g peptone 15 g yeast extract 4 g agar 990 mL dd H2O 4.5 mL 1M CaCl2 2.5 mL 40% dextrose |
|
Petri plates | Thermo Fisher Scientific | FB0875713 | for determination of bacterial concentration and phage titer assay |
Phage Buffer | Homemade, from Reference 7 | 10 mL 1 M Tris, pH 7.5 10 mL 1 M MgSO4 4 g NaCl 980 ml dd H2O |
|
R software | https://www.r-project.org/ | version 4.3.0 | |
Sterile Disposable PETG Flask Baffled Bottom w/Vented Closure | Thermo Fisher Scientific | 4116-1000 | for bacterial culture |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | 9036-19-5 | for lid coating |