Beskrevet her er en enkel arbeidsflyt for å skille endotelceller fra humane pluripotente stamceller etterfulgt av en detaljert protokoll for mekanisk stimulering. Dette muliggjør studier av endotelcellers utviklingsmekanobiologi. Denne tilnærmingen er kompatibel med nedstrømsanalyser av levende celler samlet fra kulturbrikken etter mekanisk stimulering.
Hjertet er det første organet som er funksjonelt etablert under utviklingen, og dermed starter blodsirkulasjonen svært tidlig i svangerskapet. I tillegg til å transportere oksygen og næringsstoffer for å sikre fostervekst, styrer fosterets sirkulasjon mange viktige utviklingshendelser som foregår i endotellaget gjennom mekaniske signaler. Biomekaniske signaler induserer strukturelle endringer i blodkar, etablerer arteriovenøs spesifikasjon og kontrollerer utviklingen av hematopoietiske stamceller. Utilgjengeligheten av utviklingsvevet begrenser forståelsen av sirkulasjonens rolle i tidlig menneskelig utvikling; Derfor er in vitro-modeller sentrale verktøy for studier av fartøymekanobiologi. Dette papiret beskriver en protokoll for å skille endotelceller fra humane induserte pluripotente stamceller og deres etterfølgende såing i en fluidisk enhet for å studere deres respons på mekaniske signaler. Denne tilnærmingen muliggjør langsiktig kultur av endotelceller under mekanisk stimulering etterfulgt av gjenfinning av endotelceller for fenotypisk og funksjonell karakterisering. In vitro-modellen etablert her vil være medvirkende til å belyse de intracellulære molekylære mekanismene som transducerer signaleringen mediert av mekaniske signaler, som til slutt orkestrerer fartøyets utvikling under menneskelig fosterliv.
Under embryonal utvikling er hjertet det første organet som etablerer funksjonalitet1, med påviselige sammentrekninger fra det tidligste stadiet av endokardial rørdannelse2. Sirkulasjon, sammen med de mekaniske signalene mediert av blodstrømmen i karet, styrer mange viktige aspekter ved tidlig utvikling. Før fosterets sirkulasjon etableres, er vaskulaturen organisert i en primær kapillær plexus; Ved hjertefunksjon omorganiseres denne plexus til venøs og arteriell vaskulatur3. Rollen til mekaniske signaler i arteriovenøs spesifikasjon reflekteres av det panendoteliale uttrykket av arterielle og venøse markører før blodstrømsinitiering4.
Hemodynamiske krefter styrer ikke bare utviklingen av selve vaskulaturen, men spiller også en grunnleggende rolle i kontrollen av blodcelledannelse. Hematopoietiske stam- og stamceller (HSPCer) kommer fra spesialiserte endotelceller kalt hemogent endotel 5,6,7,8, tilstede i forskjellige anatomiske regioner av embryoene utelukkende i det tidlige utviklingsstadiet. Hjertefattige modeller, sammen med in vitro-modeller, har vist at mekaniske signaler instruerer og øker HSPC-produksjonen fra det hemogene endotelet 9,10,11,12,13,14.
Ulike typer strømningsdynamikk har vist seg å differensielt kontrollere cellesyklusen15, kjent for å være viktig i både hemogent endotel 16,17 og arteriell cellespesifikasjon18. Alt i alt er mekaniske signaler kritiske determinanter for celleidentitet og funksjon under utvikling. Nye in vitro fluidiske enheter tillater oss å overvinne begrensningene som er involvert i å studere utviklingsmekanobiologi under menneskelig blodutvikling in vivo.
Det overordnede målet med protokollen i dette manuskriptet er å beskrive, trinn for trinn, den eksperimentelle rørledningen for å studere effekten av skjærspenning på humane endotelceller avledet in vitro fra humane induserte pluripotente stamceller (hiPSCs). Denne protokollen inneholder detaljerte instruksjoner om differensiering av hiPSCs i endotelceller og deres påfølgende såing i fluidiske chips for stimuleringsprotokollen. Ved hjelp av dette kan forskjellige in vitro-avledede endotelceller testes for deres evne til å føle skjærspenningen ved å analysere deres orientering som svar på strømmen. Dette vil tillate andre laboratorier å ta opp spørsmål om responsen på skjærspenning og dens funksjonelle konsekvenser på forskjellige endotelcelleidentiteter.
Protokollen som vi beskriver her tillater generering av mekanosensitive endotelceller fra humane pluripotente stamceller og studiet av deres respons på mekanisk stimulering mediert av kontrollert skjærspenning. Denne protokollen er helt cytokinbasert og fullt kompatibel med GMP-reagenser for potensiell oversettelse til produksjon av celler for celleterapi.
Utledningen av hiPSCs gir forskere en instrumentell modell for de tidlige stadiene av embryonal utvikling som muliggjør studier av prosesser som ellers er vanskelige å studere in vivo24. Faktisk samles humane embryonale vev tilgjengelig for forskning fra embryoer som mangler sirkulasjon, og dette kan ha en betydelig innvirkning på molekylærsignaturen kontrollert av mekaniske tegn. Tilnærmingen beskrevet her muliggjør live-imaging og sanntidsstudie av cellerespons på skjærspenning. Kombinasjonen av hissc med fluidikk gir en studiemodell som overvinner den begrensede tilgjengeligheten og utilgjengeligheten av det utviklende fostervevet når initiering av sirkulasjon remodellerer og kontrollerer etableringen av kardiovaskulær og blodsystem 3,9,10,25.
En begrensning av protokollen er at endotelceller avledet fra denne protokollen kanskje ikke gjenspeiler de forskjellige identitetene til forskjellige endotelceller som er tilstede i det utviklende vevet. For å overvinne denne begrensningen kan det være nødvendig med en spesifikk kombinasjon av cytokiner under differensieringsprosessen forut for den fluidiske stimuleringen for å oppnå ønsket identitet eller vevsspesifikk fenotype26. Isoleringen av endotelundergrupper kan oppnås ved bruk av en mer raffinert immunfenotype under isolasjonstrinnet. Denne protokollen isolerer endotelceller basert bare på ekspresjonen av CD34, og tillater dermed kolonneisolering i stedet for fluorescensaktivert cellesortering (FACS); Dette reduserer celledød og risikoen for forurensning. Videre er denne protokollen spesielt utviklet for å studere rollen som skjærspenning mediert av laminær strømning. Alternative fluidiske tilnærminger må brukes til å studere effekten av andre mekaniske signaler, for eksempel strekking eller kompresjon, eller andre typer strømning som forstyrret eller forstyrret strømning.
Vi har tidligere vist at iPSC-deriverte endotelceller etterligner de heterogene arteriovenøse cellulære identitetene27 tilsvarende det som er observert i fosterets dorsale aorta28,29,30. Dette er spesielt viktig i sammenheng med fartøyutvikling og cellulær spesifikasjon, kjent for å bli kontrollert av blodsirkulasjonen. Studier i ulike modeller viste at manglende sirkulasjon resulterer i endret arteriovenøs spesifikasjon11,14,31. Mekanismene som forbinder mekaniske signaler med cellespesifikasjon er fortsatt ukjente, og rørledningen beskrevet her tillater raffinerte funksjonelle studier som ikke kunne testes in vivo.
Denne rørledningen beskriver produksjon og stimulering av endotelceller avledet fra hiPSCer ved bruk av kommersielt tilgjengelige fluidiske kanaler, og unngår behovet for støping av enhetene som for de mye brukte polydimetylsiloksan (PDMS) enhetene12. Videre gjør bruken av PDMS-brikker samlingen av de stimulerte cellene spesielt utfordrende, mens med denne protokollen kan cellene enkelt hentes fra kanalen. Dette forbedrer analysekraften betydelig, noe som muliggjør påfølgende analyser som proteomiske og transkriptomiske analyser, flowcytometri og funksjonelle analyser, som kan trenge ytterligere kultur eller in vivo-analyser .
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av Research Advanced Grant 2021 fra European Hematology Association, Global Research Award 2021 fra American Society of Hematology, og Internal Strategy Support Fund ISSF3 finansiert av Welcome Trust og University of Edinburgh. Vi takker Fiona Rossi fra Flow Cytometry Facility for støtte i flowcytometrianalysen. For formålet med åpen tilgang har forfatteren anvendt en Creative Commons Attribution (CC BY)-lisens på enhver forfatterakseptert manuskriptversjon som oppstår fra denne innsendingen.
0.6 Luer uncoated slide | ibidi | IB-80186 | |
25% BSA | Life Technologies | A10008-01 | |
6-well plates | Greiner Bio-one | 657160 | |
Accutase | Life Technologies | A1110501 | Cited as Dissociation reagent |
Ascorbic acid | Merck | A4544-100G | |
Aspiration pipette | Sardtedt | 86.1252.011 | |
B27 supplement | Life Technologies | 17504044 | Cited as Neuronal cell culture supplement (50x) |
BD FACS DIVA | BD Biosciences | Version 8.0.1 | Cited as flow cytometry software |
BD LSR Fortessa 5 Laser | BD Biosciences | ||
bFGF | Life Technologies | PHG0021 | |
CD34 Microbead kit | Miltenyil Biotec | 30-046-702 | |
CD34 PE clone 4H11 | Invitrogen | 12-0349-42 | |
CD34 PerCP-eFluor 710 clone 4H11 | Invitrogen | 44-0349-42 | |
Cellstar cell-repellent surface 6-well plates | Greiner Bio-one | 657970 | Cited as cell-repellent plate |
CHIR99021 | Cayman Chemicals | 13122-1mg-CAY | |
Cryostor CS10 cell cryopreservation | Merck | C2874-100ML | Cited as Cryopreservation solution |
Dimethyl Sulfoxide | VWR | 200-664-3 | Cited as DMSO |
DMEM/F-12 | Life Technologies | 10565-018 | |
DPB Ca2+ Mg2+ | Life Technologies | 14080055 | |
DPBS | Life Technologies | 14200075 | |
EASY Strainer 40 μm | Greiner Bio-one | 542040 | |
EDTA | Life technologies | 15575020 | |
FcR Blocking Reagent | Miltenyil Biotec | 130-059-901 | |
Fiji | Version 1.53c | ||
Flow Jo | Version 10.7.1 | Cited as flow cytometry sanalysis oftware | |
FLT3L | Peprotech | 300-19-10uG | |
Fluidic unit | ibidi | 10903 | |
GlutaMax | Life Technologies | 35050038 | Cited as L-glutamine supplement |
Ham F-12 | Life Technologies | 11765054 | |
Holo-transferrin | Merk | T0665-500MG | |
Human Serum Albumin | Fujifilm UK LTD | 9988 | |
Ibidi Pump system | ibidi | 10902 | Cited as Pump system |
IMDM | Life Technologies | 12440053 | |
Inverted microscope | ioLight/Thisle Scientific | IOL-IO-INVERT | Cited as inverted in-incubator microscope |
Lyophilised BSA | Merck | A2153-100G | |
MiniMACS Separator | Miltenyil Biotec | 130-042-102 | Cited as Magnetic separator |
MS Columns | Miltenyil Biotec | 130-042-201 | Cited as Magnetic column |
MTG | Merck | M6145-25ML | |
N2 supplement | Life Technologies | 17502048 | |
Notebook for pump system | ibidi | 10908 | |
Paraformaldehyde 37-41% | Fisher Chemicals | F/1501/PB15 | |
Pastette | Greiner Bio-one | 612398 | |
Pen/Strep | Gibco | 15070063 | |
Perfusion Set YELLOW/GREEN: 50 cm, ID 1.6 mm, 10 mL reservoirs | Ibidi | IB-10964 | Cited as Perfusion set |
Polystyrene Round Bottom Tubes | Falcon | 352008 | Cited as Flow cytometry tubes |
Prism 9 | Verison 9.4.0 | ||
Pump control software | ibidi | version 1.6.1 | Cited as Pump software |
ReLeSR | Stem cell tecchonologies | 5872 | Cited as Detaching solution |
rhBMP4 | R&D | 314-BP-010 | |
rhEPO | R&D | 287-TC-500 | |
rhIGF1 | Peprotech | 100-11-100uG | |
rhIL11 | Peprotech | 200-11-10uG | |
rhIL3 | Peprotech | 200-03-10uG | |
rhIL6 | R&D | 206-IL-010 | |
rhLaminin-521 | Life technologies | A29248 | Cited as Laminin |
rhSCF | Life Technologies | PHC2111 | |
rhTPO | R&D | 288-TPN-025 | |
rhVEGF | R&D | 293-VE-010 | |
RLT Lysis Buffer | Qiagen | 79216 | |
Serial Connector for µ-Slides: Sterile, Sterile | ibidi | IB-10830 | |
StemPro-CD34 SFM media | Life Technologies | 10639011 | Cited as Serum-Free media for CD34+ cells (SFM-34) |
StemPro-CD34 Nutrient Supplement | Life Technologies | 10641-025 | Cited as 34 nutrient supplement |
StemPro hESC SFM | Life Technologies | A1000701 | Cited as Culture media |
StemPro supplement | Life Technologies | A10006-01 | |
Vitronectin (VTN-N) recombinant human protein, truncated | Invitrogen | A31804 | |
Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | Cited as iRock |
β-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 |