Att upprätthålla oocytgenomets integritet är nödvändigt för att säkerställa den genetiska troheten i det resulterande embryot. Här presenterar vi ett exakt protokoll för att upptäcka DNA-dubbelsträngsbrott i kvinnliga könsceller hos däggdjur.
Oocyter är bland de största och mest långlivade cellerna i kvinnokroppen. De bildas i äggstockarna under embryonal utveckling och förblir stoppade vid profasen av meios I. Det vilande tillståndet kan pågå i flera år tills oocyterna får en stimulans att växa och få kompetensen att återuppta meiosen. Detta utdragna tillstånd av arrestering gör dem extremt mottagliga för att ackumulera DNA-skadliga förolämpningar, vilket påverkar den genetiska integriteten hos de kvinnliga könscellerna och därmed den genetiska integriteten hos det framtida embryot.
Följaktligen är utvecklingen av en exakt metod för att upptäcka DNA-skador, vilket är det första steget för att fastställa mekanismer för DNA-skador, av avgörande betydelse. Denna artikel beskriver ett vanligt protokoll för att testa närvaron och utvecklingen av DNA-skador i profas-arresterade oocyter under en period av 20 timmar. Specifikt dissekerar vi musäggstockar, hämtar cumulus-oocytkomplexen (COC), tar bort cumuluscellerna från COC och odlar oocyterna i Μ2-medium som innehåller 3-isobutyl-1-metylxantin för att upprätthålla stopptillståndet. Därefter behandlas oocyterna med det cytotoxiska, antineoplasmatiska läkemedlet etoposid för att framkalla dubbelsträngsbrott (DSB).
Med hjälp av immunofluorescens och konfokalmikroskopi detekterar och kvantifierar vi nivåerna av kärnproteinet γH2AX, som är den fosforylerade formen av histonen H2AX. H2AX fosforyleras på platserna för DSB efter DNA-skador. Oförmågan att återställa DNA-integriteten efter DNA-skador i oocyter kan leda till infertilitet, fosterskador och ökad frekvens av spontana aborter. Därför är förståelsen av mekanismer för DNA-skador och samtidigt etablerandet av en intakt metod för att studera dessa mekanismer avgörande för reproduktionsbiologisk forskning.
Meiosprocessen i kvinnliga könsceller hos däggdjur initieras i äggstockarna före födseln. Det totala antalet oocyter etableras i äggstockarna främst under embryogenesen. Oocyter går in i meios och förblir arresterade vid profas I1. Efter puberteten och produktionen och den endokrina verkan av follikelstimulerande hormon (FSH) och luteiniserande hormon (LH) kan oocyter återinitiera och fullborda meios2. Hos människor kan profasstopp pågå i upp till 50 år3. Celldelningarna efter inträdet i meios I är asymmetriska, vilket resulterar i produktion av en liten polär kropp och en oocyt som behåller sin storlek. Således lagras de flesta cytoplasmatiska komponenter i ooplasman under tidig embryogenes4. Sedan går oocyterna in i meios II, utan att reformera sin kärna eller dekondensera sina kromosomer, och förblir stoppade vid metafas II fram till befruktning5.
En unik egenskap som skiljer oocyter från somatiska celler är tillståndet av stopp i profas I, när oocyten har en intakt kärna (germinal vesikel [GV] arrest), kallad GV stadium6. Baserat på kromatinorganisationen klassificeras oocyter i GV-stadiet i två kategorier: icke-omringad nukleol (NSN) och omgiven nukleol (SN)7,8. I NSN GV-oocyter sprider sig kromatinet över hela kärnregionen och transkriptionen är aktiv, medan i SN-oocyter bildar kromatinet en kompakt ring som omger nukleolen, och transkriptionen är tyst9. Båda typerna av oocyter i GV-stadiet visar meiotisk kompetens; de går in i meios i samma takt, men NSN-oocyterna har låg utvecklingskapacitet och kan inte utvecklas längre än till tvåcellsstadietembryo 10.
Det utdragna tillståndet för profas I-arrestering ökar förekomsten av ansamling av DNA-skador11. Därför är mekanismer för DNA-skador i oocyter avgörande för att möjliggöra produktion av könsceller med genetisk integritet och för att säkerställa att det resulterande embryot har ett fysiologiskt kromosomalt innehåll.
En central aspekt av DNA-skaderesponsen är DNA-reparation. De viktigaste vägarna för DSB-reparation i eukaryota celler inkluderar icke-homolog ändsammanfogning (NHEJ), homolog rekombination (HR) och alternativ NHEJ12,13,14,15. NHEJ är en snabbare men mer felbenägen mekanism, medan HR kräver mer tid för att slutföras men har hög trohet16.
Det finns inte tillräckligt med kunskap om de mekanismer som oocyter använder för att reparera DNA-skador. Studier har visat att DNA-skador som induceras i fullvuxna däggdjursoocyter genom användning av genotoxiska ämnen, såsom etoposid, doxorubicin eller UVB eller joniserande strålning, inte påverkar tidpunkten och hastigheten för utträde från profasI-arrest. Oocyter kan genomgå GV-nedbrytning (GVBD) även i närvaro av förhöjda nivåer av skador. Denna skada kan bestämmas genom observation av γH2AX. Denna fosforylerade form av H2AX (γΗ2ΑΧ) är en DSB-markör, som är belägen på platsen för brott och fungerar som en byggnadsställning för att hjälpa reparationsfaktorer och proteiner att ackumuleras vid trasiga ändar18.
Frånvaron av cellcykelstopp efter DNA-skada beror på en otillräcklig kontrollpunkt för DNA-skador som gör det möjligt för oocyter med oreparerat DNA att återinträda i meios. Efter höga nivåer av DNA-skador kan en kontrollpunkt upprätthålla profasstopp genom aktivering av en ATM/Chk1-beroende väg. Det begränsade svaret från kontrollpunkterna på de digitala kontrollorganen beror på den begränsade aktiveringen av ATM17,19. I M-fasen av meios I har forskning visat att DNA-skador kan aktivera en spindle assembly checkpoint (SAC)-inducerad meios I-kontrollpunkt, vilket förhindrar aktivering av E3 ubiquitin-ligaset anafasfrämjande komplex/cyklosom (APC/C) och därmed M-fasutgång. Dessutom övervinner ablationen av SAC-proteiner tillståndet för M-fasstopp, vilket understryker vikten av SAC i etableringen av meiosen I chekpoint20.
Som tidigare forskning tydligt visar kan DSB inte inducera en robust profaskontrollpunkt i musoocyter. Om sådana skador inte repareras kan det leda till att embryon bär på kromosomavvikelser. Därför är det viktigt att studera DNA-skaderesponsen i olika stadier av kvinnlig gametogenes för att bättre förstå de unika vägar som oocyter använder för att hantera potentiella genetiska förolämpningar.
Genom att använda den metod som beskrivs här upptäckte vi DSB i däggdjursoocyter. Denna metod gör det möjligt att upptäcka och studera DNA-reparationsprocessen i oocyter. Samma protokoll skulle också kunna användas för att analysera andra proteiner som deltar i fysiologiska processer i däggdjurs äggceller. Det är viktigt att studera hur oocyter reagerar på potentiella DNA-skador för att bättre förstå orsaken till kvinnlig subfertilitet hos människor.
Att studera DNA-skaderesponsen i däggdjurs oocyter kan vara utmanande på grund av oocyternas känslighet. Hantering av oocyter kräver specifika temperaturer och CO 2 och O2 koncentrationer. Samtidigt måste oocyterna skyddas från ljus. Αll-hantering bör göras genom att använda glaspipetter som inte är för smala, eftersom detta kan vara skadligt för oocyterna, men inte heller för breda, eftersom detta kan orsaka utspädning av mediet och därmed påverka fixeringsproceduren negativt. I varje steg av fixeringen används flera droppar buffertar för att minimera utspädningseffekten. Ett alternativt sätt att observera DSB är Comet-analysen24. Även om denna teknik är känsligare är den mer komplicerad. Samtidigt är det inte möjligt att med hjälp av Comet-analysen detektera den exakta DNA-regionen där skadan uppstår, och i celler med rikligt med RNA-molekyler, som GV-oocyter25, kan bakgrunden ökas, vilket leder till en falsk DNA-skadesignal26.
Genom att använda immunofluorescensprotokollet som beskrivs här kan vi detektera DSB med noggrannhet och uppskatta reparationsförloppet i GV-stadiets oocyter, vilket indikeras av minskningen av γH2AX-fluorescens över tid. En begränsning med denna metod är dock att vissa antikroppar kan uppvisa ospecifik distribution i hela ooplasman, vilket leder till bilder med hög bakgrundsfluorescens. PFA-Tx-100-bufferten används istället för sekventiell PFA och Tx-100, eftersom vi har observerat att den förbättrar fixeringsprocessen genom att tillåta detektion av mindre bakgrunds- och icke-specifik fluorescens. En andra begränsning med att använda γH2AX för DSB-detektion är att skador inte kan uppskattas efter GVBD på grund av den spontana fosforyleringen av γH2AX i meios23.
I detta immunofluorescensprotokoll förblir oocyterna i en vätskebuffert och kan inte lagras i objektglas. Detta faktum gör det svårt att bevara de fasta cellerna i flera dagar efter tillsatsen av den sekundära antikroppen. För att få bilder av god kvalitet och för att inte tappa signalen är det att föredra att utföra avbildningen inom några timmar efter tillsats av den sekundära antikroppen. Det bör också noteras att skanningen av kärnorna genom Z-axeln kan göra att signalen blir svagare på grund av överexponering. Av den anledningen är det att föredra att sänka lasereffekten och öka skanningshastigheten.
Slutligen, en annan begränsning med immunofluorescensprotokollet är att det endast kan användas för fixerade/icke-levande celler. Därför kan vi bara uppskatta närvaron och frånvaron av faktorer vid specifika tidpunkter utan att veta om det finns några fluktuationer i deras koncentration eller förändringar i deras beteende över tid. Detta problem skulle kunna övervinnas genom att använda avbildning av levande celler och fluorescerande märkta markörer.
The authors have nothing to disclose.
Vi erkänner stöd för detta arbete från projektet “Etablering av ‘kapacitetsbyggande’ infrastrukturer inom biomedicinsk forskning (BIOMED-20)” (MIS 5047236), som genomförs inom ramen för åtgärden “Förstärkning av forsknings- och innovationsinfrastrukturen”, finansierad av det operativa programmet “Konkurrenskraft, entreprenörskap och innovation” (NSRF 2014-2020), och samfinansierad av Grekland och Europeiska unionen (Europeiska regionala utvecklingsfonden).
3 mL Pasteur pipettes in LDPE, graduated | APTACA | 1502 | |
10 cc syringes | SoftCare | 114.104.21 | |
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit Secondary Ab | Biotium | 20012 | |
Anti-phospho-H2A.X (Ser139) | Merck Millipore | 07-164 | |
ARE Heating Magnetic Stirrer | VELP Scientifica | F20500162 | |
BD FALCON 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tubes | BD Biosciences | 352054 | |
BD Microlance 3 Needles 27 G – 0.40 x 13 mm | Becton Dickinson | 300635 | |
Bovine Serum Albumin Fraction V | Roche | 10735078001 | |
DMSO Anhydrous | Biotium | 90082 | |
DRAQ7 DNA dye | BioStatus | DR71000 | |
EGTA | Sigma-Aldrich | E4378-25G | |
EMSURE MgCl2. 6H2O | Merck Millipore | 1058330250 | |
Etoposide | CHEMIPHARM | L01CB01 | |
FALCON 14 mL Polystyrene Round-Bottom Tubes | Corning Science | 532057 | |
FALCON Tissue Culture Dishes, Easy-Grip, 35 x 10 mm Style | Corning Science | 353001 | |
Glass Bottom Culture Dishes (35 mm Petri dish/ 14 mm Microwell, No. 0 coverglass) | MatTek Corporation | P35G-0-14-C | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H6147-25G | |
HERACELL 150i CO2 Incubator | ThermoFisher Scientific | 50116048 | |
IBMX powder | Sigma-Aldrich | I5879-100MG | |
Leica M125 Stereo Microscope | Leica Microsystems | ||
M16 Medium | Sigma-Aldrich | M7292 | |
M2 Medium | Sigma-Aldrich | M7167 | |
Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M5310 | |
NaN3 | Honeywell | 13412H | |
NaOH | Merck Millipore | 1064981000 | |
Nikon AX ECLIPSE Ti2 Confocal Microscope | Nikon Corporation | ||
Nikon SMZ800N Stereo Microscope | Nikon Corporation | ||
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
Pasteur pippettes, glass, long form 230 mm | DURAN WHEATON KIMBLE | 357335 | |
pH/ORP meter | Hanna Instruments Ltd | HI2211 | |
Phosphate buffered saline tablets | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
PIPES | Sigma-Aldrich | P1851 | |
PMSG Protein Lyophilised | Genway Biotech (now AVIVA Systems Biology) | GWB-2AE30A (now OPPA01037) | |
QBD4 Dry block heater | Grant Instruments (Cambridge) Ltd | A25218 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
Whatman Puradisc 25 mm 0.2 μm filters | GE Healthcare | 6780-2502 |