यहां, हम जीन थेरेपी वैक्टर के नैदानिक विकास के समर्थन में ड्रॉपलेट डिजिटल पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन द्वारा मानव आँसू में एडेनो से जुड़े वायरल वैक्टर के अनुपालन का पता लगाने में अच्छी प्रयोगशाला प्रथाओं के विकास और सत्यापन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।
आनुवंशिक रोगों के इलाज के लिए वायरल वैक्टर का उपयोग हाल के वर्षों में काफी बढ़ गया है, आज तक 2,000 से अधिक अध्ययन पंजीकृत हैं। एडेनो से जुड़े वायरल (एएवी) वैक्टर को आंखों से संबंधित बीमारियों के उपचार में विशेष सफलता मिली है, जैसा कि वोरेटिजीन नेपरवोवेक-आरजाइल के अनुमोदन से उदाहरण मिलता है। बाजार में नए उपचार लाने के लिए, नियामक एजेंसियां आमतौर पर पर्यावरण में वेक्टर की रिहाई का मूल्यांकन करने के लिए योग्य या मान्य बायोशेडिंग अध्ययनों का अनुरोध करती हैं। हालांकि, संयुक्त राज्य अमेरिका के खाद्य और औषधि प्रशासन द्वारा इस तरह के शेडिंग अध्ययनों का समर्थन करने के लिए आणविक आधारित परख के विकास के लिए कोई आधिकारिक दिशानिर्देश जारी नहीं किए गए हैं, जिससे डेवलपर्स को अपने लिए सर्वोत्तम प्रथाओं को निर्धारित करने के लिए छोड़ दिया गया है। इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य नैदानिक बायोशेडिंग अध्ययनों के समर्थन में ड्रॉपलेट डिजिटल पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (डीडीपीसीआर) द्वारा मानव आंसुओं में एएवी वैक्टर का पता लगाने के लिए एक मान्य प्रोटोकॉल प्रस्तुत करना है। यह पांडुलिपि आणविक परख सत्यापन के लिए वर्तमान उद्योग दृष्टिकोण पर चर्चा करती है और दर्शाती है कि विधि वर्तमान में श्वेत पत्रों में प्रस्तावित लक्ष्य परख स्वीकृति मानदंडों से अधिक है। अंत में, किसी भी डीडीपीसीआर परख के प्रदर्शन में महत्वपूर्ण कदम, आवेदन की परवाह किए बिना, चर्चा की जाती है।
जीन थेरेपी की परिभाषाएं अलग-अलग होती हैं, लेकिन आम तौर पर एक जीन की अभिव्यक्ति को संशोधित करने या हेरफेर करने यानैदानिक उद्देश्य के लिए जीवित कोशिका के जैविक गुणों को बदलने के लिए सेलुलर जीनोम के एक विशिष्ट डीएनए अनुक्रम के जानबूझकर और अक्सर अपेक्षित स्थायी परिवर्तन को प्रेरित करती हैं। वायरल वैक्टर को ट्रांसडक्शन की दक्षता के कारण जीन थेरेपी के लिए वाहनों के रूप में तेजी से उपयोग किया जा रहा है, एक रिपोर्ट में सुझाव दिया गया है कि वर्तमान जीन थेरेपी नैदानिक परीक्षणों में से 70% से अधिक वायरल वैक्टर3 का उपयोग करते हैं। जीन थेरेपी के लिए वायरल वैक्टर में रुचि लगातार बढ़ रही है। अमेरिकन सोसाइटी ऑफ जीन एंड सेल थेरेपी से जीन, सेल और आरएनए थेरेपी परिदृश्य पर तिमाही 4 2022 त्रैमासिक डेटा रिपोर्ट ने बताया कि 2022 में, प्रीक्लिनिकल से प्री-रजिस्ट्रेशन तक जीन, सेल और आरएनए थेरेपी पाइपलाइन में 7% की वृद्धि हुई, जिससे विकास में उपचारों की कुल संख्या 3,726 हो गई, जिनमें से 2,053 (55%) जीन थेरेपीथे।. यूनाइटेड स्टेट्स फूड एंड ड्रग एडमिनिस्ट्रेशन (यूएसए एफडीए) ने वर्तमान में मनुष्यों में नैदानिक उपयोग के लिए 27 सेल और जीन थेरेपी को मंजूरी दी है, जिनमें से पांच विशेष रूप से वायरल वैक्टर5 का उपयोग करते हैं।
एडेनो से जुड़े वायरस (एएवी) ने जीन थेरेपी के लिए वाहनों के रूप में विशिष्ट रुचि प्राप्त की है। हाल ही में एक मेटा-विश्लेषण से पता चला है कि पिछले दो दशकों में एएवी के उपयोग की जांच करने वाले लगभग 136 नैदानिक परीक्षण हुएहैं। इसके अतिरिक्त, पांच यूएसए एफडीए अनुमोदित जीन उपचारों में से तीन एएवी आधारित हैं। यह उनकी अत्यधिक संपादन योग्य प्रकृति, व्यापक मेजबान रेंज के कारण है जिसे विशिष्ट प्राकृतिक रूप से होने वाले या कृत्रिम रूप से इंजीनियर किए गए वैक्टर, मनुष्यों में कम रोगजनकता और विषाक्तता और आम तौर पर कम इम्युनोजेनेसिटी 7,8 के उपयोग के आधार पर ट्यून किया जा सकता है। एएवी का उपयोग एक अनुमोदित नैदानिक सेटिंग में नेत्र रोगों के इलाज के लिए भी सफलतापूर्वक किया गया है। वोरेटिजीन नेपरवोवेक-आरज़िल एक एएवी 2-आधारित थेरेपी है जिसे 2017 में यूएसए एफडीए द्वारा और 2018 में यूरोपीय मेडिसिन एजेंसी (ईएमए) द्वारा बायलेल आरपीई 65 उत्परिवर्तन से जुड़े रेटिना डिस्ट्रॉफी9 के इलाज के लिए अनुमोदित किया गया था।
एएवी-आधारित उपचारों के विकास में बढ़ती रुचि के साथ परख पर नियामक मार्गदर्शन की आवश्यकता आती है। किसी भी वायरल वेक्टर का सटीक पता लगाना और परिमाणीकरण उत्पाद विकास की खोज, विनिर्माण और प्रीक्लिनिकल / नैदानिक परीक्षण चरणों का एक अभिन्न अंग है। यूएसए एफडीए ने जीन थेरेपी के लिए कुछ मार्गदर्शन जारी करना शुरू कर दिया है, जिसमें रसायन विज्ञान, विनिर्माण और मानव जीन थेरेपी के लिए नियंत्रण पर नई दवा अनुप्रयोगोंकी जांच 10, जीन थेरेपी 11 के प्रशासन के बाद दीर्घकालिक अनुवर्ती, प्रतिकृति-सक्षम रेट्रोवायरस परीक्षण12, और जीन थेरेपी13 में उपयोग किए जाने वाले माइक्रोबियल वैक्टर के लिए सिफारिशें शामिल हैं।. ईएमए ने जीन थेरेपी उत्पादों के विकास से संबंधित दिशानिर्देशों की एक श्रृंखला भी जारी की है जो आम तौर पर एफडीए सिफारिशों के साथ संरेखित होते हैं, हालांकि कुछअंतर मौजूद हैं। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि हालांकि ये मार्गदर्शन कानूनी रूप से लागू करने योग्य जिम्मेदारियों को स्थापित नहीं करते हैं, सिवाय इसके कि जहां विशिष्ट नियमों को संदर्भित किया जाता है, वे इस विषय पर नियामक एजेंसियों से वर्तमान सोच और दवा फाइलिंग और नियामक अनुमोदन के लिए आवश्यक परख के लिए उनकी अपेक्षाओं पर स्पष्टता प्रदान करते हैं।
एफडीए विशेष रूप से सिफारिश करता है कि ओकुलर और गैर-ओकुलर ऊतकों, इंट्राओकुलर तरल पदार्थ और रक्त15 को लक्षित करने के लिए प्रशासन की साइट से वेक्टर के वितरण, दृढ़ता और निकासी का आकलन करने के लिए अध्ययन किया जाना चाहिए। ये जैव वितरण और शेडिंग अध्ययन का रूप लेते हैं। जैव वितरण अध्ययन यह जांचकर जोखिम का मूल्यांकन करते हैं कि प्रशासन की साइट से रोगी के शरीर में एक उत्पाद कैसे फैलता है। शेडिंग विशेष रूप से रोगी से पर्यावरण में उत्पाद की रिहाई का मूल्यांकन करता है और अनुपचारितव्यक्तियों में वेक्टर के संचरण की संभावना बढ़ाता है। एफडीए नमूना संग्रह की आवृत्ति, नमूना संग्रह की अवधि, एकत्र किए गए नमूनों के प्रकार और भंडारण की स्थिति के संबंध में जैव वितरण और शेडिंग अध्ययन के डिजाइन के लिए सिफारिशें करता है।
इसके अतिरिक्त, एफडीए प्रदर्शन में आसानी, उच्च-थ्रूपुट प्रारूप, तेजी से बदलाव के समय और परख संवेदनशीलता के कारण वेक्टर जीनोम की मात्रात्मक पहचान के लिए मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (क्यूपीसीआर, या रीयल-टाइम पीसीआर) के उपयोग की सिफारिश करता है। हालांकि, छोटे और बड़े अणुओं के लिए मौजूद लोगों की तुलना में आणविक विधियों के डिजाइन और प्रदर्शन मूल्यांकन के लिए सिफारिशों की सापेक्ष कमी है। इस तरह के अध्ययनों के लिए कई दिशानिर्देश दोनों उत्पादों और परख ों के अद्वितीय और जटिल डिजाइन के कारण आणविक विधियों पर लागू करना मुश्किल है, जो अनुशंसित आकलन के लिए उपलब्ध प्लेटफार्मों की उपयुक्तता और परख सत्यापन के लिए उपयुक्त तरीकों के बारे में सवाल उठाते हैं। आज तक, एफडीए को पीसीआर-आधारित परखों के औपचारिक सत्यापन की आवश्यकता नहीं है, हालांकि ईएमए ने इस आवश्यकताको लागू किया है। इस शून्य के प्रकाश में, विभिन्न समूहों और कार्यशालाओं ने श्वेत पत्र और सिफारिशें जारी की हैं जिन्हें निर्माताओं और अनुबंध अनुसंधान संगठनों ने 18,19,20,21,22,23,24,25 का पालन करने की मांग की है। इनमें से अधिकांश सिफारिशें विशेष रूप से क्यूपीसीआर परखों को ध्यान में रखते हुए लिखी गई हैं, जिसमें उभरते प्लेटफार्मों के लिए सुझाव या परिवर्तन हैं, जैसे कि ड्रॉपलेट डिजिटल पीसीआर (डीडीपीसीआर), केवल प्रासंगिक माना जाता है। हाल की सिफारिशों ने डीडीपीसीआर परख ों के लिए विचारों पर ध्यान केंद्रित किया है, लेकिन बायोशेडिंग अध्ययनों में सामना किए गए जटिल जैविक मैट्रिक्स के बजाय विनिर्माण सेटिंग में वेक्टर जीनोम परिमाणीकरण के लिए उनके अनुप्रयोगों पर काफी हद तक ध्यान केंद्रित किया है।
नैदानिक अनुप्रयोग और लक्ष्यों के आधार पर, डीडीपीसीआर की तुलना में डीडीपीसीआर की बढ़ती संवेदनशीलता और मैट्रिक्स हस्तक्षेप को संभालने की क्षमता के कारण जैव वितरण और शेडिंग अध्ययनों के समर्थन में क्यूपीसीआर पर डीडीपीसीआर को प्राथमिकता दी जा सकती है। इसके अलावा, लगभग 20,000 बूंदों में नमूनों के विभाजन के कारण, पॉइसन आंकड़ों का उपयोग करके मानक वक्र के उपयोग के बिना कॉपी संख्या का सटीक परिमाणीकरण प्राप्त किया जा सकता है, विधि विकास और सत्यापन को सरल बनाता है। इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य नैदानिक बायोशेडिंग अध्ययनों के समर्थन में ओकुलर सतह से एकत्र किए गए आंसुओं में एएवी वैक्टर का पता लगाने के लिए डीडीपीसीआर-आधारित विधि के विकास और सत्यापन के लिए एक मानकीकृत दृष्टिकोण का वर्णन करना है।
डीडीपीसीआर प्रोटोकॉल के कई चरण हैं जो परख के उचित प्रदर्शन के लिए महत्वपूर्ण हैं। पहला महत्वपूर्ण कदम प्राइमरों और जांच का डिजाइन और अनुकूलन है। सामान्य तौर पर, प्रीक्लिनिकल या नैदानिक सेटिंग में डाई-आधारित रसायन विज्ञान (जैसे, एसवाईबीआर ग्रीन) पर हाइड्रोलिसिस जांच-आधारित रसायन विज्ञान का उपयोग उनकी बेहतर विशिष्टता के कारण अनुशंसित है। इसके अतिरिक्त, प्रवर्धन लक्ष्य का विकल्प एक महत्वपूर्ण है। आमतौर पर, वेक्टर के हित के ट्रांसजीन को लक्षित किया जाता है। हालांकि, पहले प्रीक्लिनिकल चरणों में या वैक्टर में जहां वेक्टर ट्रांसजेन बनाम जीनोमिक डीएनए को अलग करना संभव नहीं हो सकता है, मानकीकृत वेक्टर लक्ष्यों का उपयोग करना उचित हो सकता है। उदाहरण के लिए, कोई इन वेक्टर घटकों के बीच उल्टे टर्मिनल रिपीट क्षेत्र, प्रमोटर, पॉली-ए टेल, या अंतर-खंड जंक्शनों को लक्षित कर सकता है। लक्ष्य की पसंद वेक्टर डिजाइन के आधार पर अलग-अलग होगी। पारंपरिक क्यूपीसीआर प्राइमर और जांच डिजाइन रणनीतियों और सॉफ्टवेयर आमतौर पर डीडीपीसीआर के लिए उपयुक्त हैं। डिजाइन पैरामीटर जो एक सुसंगत एनीलिंग तापमान (उदाहरण के लिए, 60 डिग्री सेल्सियस) उत्पन्न करने की उम्मीद करते हैं, उन्हें आवश्यक अनुकूलन की मात्रा को कम करने के लिए चुना जाना चाहिए। प्रत्येक लक्ष्य के लिए कम से कम तीन अलग-अलग सेटों को डिजाइन, आदेश और मूल्यांकन करने की भी सिफारिश की गई है। फिर किसी को उस सेट का चयन करना चाहिए जो सबसे बड़ी विशिष्टता दिखाता है (नकारात्मक नियंत्रण में या संबंधित लक्ष्य डीएनए के मैट्रिक्स में कोई प्रवर्धन नहीं) और संवेदनशीलता (यानी, पहचान की सीमा)20।
यदि क्यूपीसीआर और डीडीपीसीआर के बीच परख को संक्रमण करने में सक्षम होना फायदेमंद है, तो पहले क्यूपीसीआर का उपयोग करके परख स्थितियों को अनुकूलित करने की सिफारिश की जाती है, और चयनित सेट के लिए स्थितियों की पहचान करने के लिए जिसके परिणामस्वरूप आर2 ≥ 0.98 के साथ 90% -110% की प्रवर्धन क्षमता होती है। हालांकि, एक समापन बिंदु विधि के रूप में डीडीपीसीआर आमतौर पर प्रवर्धन क्षमता में भिन्नता के कारण क्यूपीसीआर की तुलना में कम संवेदनशील होता है। कम से कम, अपेक्षित एनीलिंग तापमान से ऊपर और नीचे के तापमान को कवर करने और तापमान के कार्य के रूप में नकारात्मक और सकारात्मक बूंद समूहों के बीच बारिश और फ्लोरोसेंट आयाम पृथक्करण का मूल्यांकन करने के लिए एनीलिंग / विस्तार चरण में थर्मल तापमान ढाल चलाने की सिफारिश की जाती है। यदि कार्यस्थान अनुमति देता है, तो मास्टर मिक्स तैयारी, टेम्पलेट जोड़ने और प्रवर्धन के लिए अलग-अलग समर्पित वर्कस्टेशन रखने की सिफारिश की जाती है। जहां संभव हो, इन्हें भौतिक रूप से अंतर्निहित इंजीनियरिंग नियंत्रणों के साथ एक यूनिडायरेक्शनल वर्कफ़्लो द्वारा अलग किया जाना चाहिए, जैसे कि नियंत्रित पहुंच और अंतर वायु दबाव, क्रॉस संदूषण और झूठे सकारात्मक के जोखिम को कम करने के लिए। यदि यह संभव नहीं है, तो क्रॉस संदूषण को रोकने के लिए अत्यधिक सावधानी बरतनी चाहिए।
इस प्रोटोकॉल में दो चरण हैं जो उन लोगों के लिए असामान्य दिखाई दे सकते हैं जो क्यूपीसीआर परख विकास के अधिक आदी हैं। पहला पीसीआर मास्टर मिश्रण में एक प्रतिबंध एंजाइम का समावेश है। डीडीपीसीआर प्रवर्धन के दौरान, प्रत्येक बूंद को समापन बिंदु तक थर्मोसाइकिल किया जाता है। एक उचित रूप से अनुकूलित परख में, इसके परिणामस्वरूप बूंदों की दो आबादी होती है, एक सेट फ्लोरोसेंट संकेतों के लगातार उच्च स्तर को प्रदर्शित करता है- सकारात्मक- और दूसरा लगातार फ्लोरोसेंट सिग्नल के निम्न स्तर को प्रदर्शित करता है- नकारात्मक। यदि पीसीआर हस्तक्षेप होता है, तो यह पीसीआर प्रवर्धन की शुरुआत को डीसिंक्रनाइज़ कर सकता है, जिसके परिणामस्वरूप बूंद एक प्रवर्धन पठार तक नहीं पहुंच पाती है, और इस प्रकार असंगत फ्लोरोसेंट एंडपॉइंट होते हैं। इस मामले में, बूंदों को नकारात्मक और सकारात्मक के बीच वितरित किया जाएगा, जिसके परिणामस्वरूप डीडीपीसीआर बारिश नामक घटना होगी। इसके परिणामस्वरूप लक्ष्य का गलत परिमाणीकरण और असंगत और व्यक्तिपरक रूप से लागू थ्रेसहोल्ड हो सकता है। एनटीसी के सिग्नल से थोड़ा ऊपर सीमा निर्धारित करने की हमारी सिफारिश, जिसे अंतिम परिमाणीकरण में बारिश के प्रभाव को कम करना चाहिए क्योंकि सभी बूंदों को अभी भी सकारात्मक माना जाता है, भले ही समापन बिंदु पर पूरी तरह से चक्रित न किया जाए। एएवी में एक अत्यधिक जटिल माध्यमिक संरचना होती है, जो प्रवर्धन लक्ष्य के आधार पर, प्राइमरों और जांच तक पहुंच को कम कर सकती है, जिसके परिणामस्वरूप पीसीआर हस्तक्षेप होता है और इस प्रकार बारिश होती है। मास्टर मिक्स में प्रतिबंध एंजाइम को शामिल करने से इस द्वितीयक संरचना को प्राइमरों और जांच द्वारा पहुंच बढ़ाने के लिए छोड़ दिया जाता है, जिससे बारिश कम हो जाती है, जिससे परख की सटीकता में सुधार हो सकता है। डीडीपीसीआर प्रतिक्रिया में एक प्रतिबंध एंजाइम को शामिल करने के प्रभावों को पहले25,32 वर्णित किया गया है। किसी भी प्रतिबंध एंजाइम का उपयोग किया जा सकता है, जब तक कि यह लक्ष्य प्रवर्धन क्षेत्र के भीतर कटौती नहीं करने की पुष्टि की जाती है। कोई प्रीडाइजेशन स्टेप या वैकल्पिक बफर रचनाओं की आवश्यकता नहीं है।
दूसरा असामान्य कदम एएवी युक्त आंसू नमूने की तैयारी है। इस प्रोटोकॉल में, आँसू के 1: 10 (या अधिक) अनुपात का उपयोग किया गया था और बाद में नमूने को गर्म किया गया था। आमतौर पर, जब आँसू एक केशिका ट्यूब के माध्यम से एकत्र किए जाते हैं, जो एक व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली संग्रह विधि है, तो औसतन लगभग 10.0 μLएकत्र किया जा सकता है। कमजोर पड़ने से सीमित नमूना मात्रा को संबोधित करने और डुप्लिकेट अच्छी तरह से परीक्षण के लिए पर्याप्त सामग्री प्रदान करने में मदद मिलती है। हालांकि यह पता लगाने की सैद्धांतिक सीमा को कम करता है, डीडीपीसीआर की मजबूत संवेदनशीलता के परिणामस्वरूप अभी भी वेक्टर कणों की एक बहुत कम संख्या का पता लगाया जाना चाहिए। यह दृष्टिकोण अतिरिक्त रूप से एक “बैकअप” बनाता है यदि कोई अप्रत्याशित रूप से विफल हो जाता है। इस मामले में, या दो कुओं को चलाने के लिए अपर्याप्त नमूना मात्रा के मामलों में, परिशुद्धता का आकलन करने के लिए पॉइसन त्रुटि का उपयोग किया जा सकता है। इसके अलावा, ऐसे मामलों में जहां एकाग्रता पहचान की सीमा से नीचे है, यह एकाग्रता निर्धारित करने के लिए अच्छी तरह से डेटा को विलय करने का अवसर बनाता है। डीडीपीसीआर का पता लगाने के लिए वायरल कैप्सिड ्स से एएवी वैक्टर को मुक्त करना आवश्यक है। एएवी के परिमाणीकरण के लिए कुछ तरीकों में वायरल कैप्सिड34,35,36 को हटाने के लिए एक प्रोटीन के पाचन चरण शामिल है। सभी प्राकृतिक रूप से होने वाले एएवी सीरोटाइप में लगभग 90 डिग्री सेल्सियस या उससे नीचे पिघलने का तापमान होता है, जिसमें से अधिकांश 80 डिग्री सेल्सियस से नीचे गिर जाते हैं; इसलिए, यह एकअनावश्यक समावेश प्रतीत होता है। वेक्टर डीएनए को जारी करने के लिए अकेले हीटिंग पर्याप्त प्रतीत होता है।
इसके अलावा, डीडीपीसीआर आमतौर पर पीसीआर अवरोधकों के लिए कम संवेदनशील होता है जो एक नमूने में मौजूद हो सकता है जो क्यूपीसीआर परख को प्रभावित कर सकता है। यदि एक विशिष्ट डीएनए अलगाव चरण शामिल है, तो इसके लिए विशिष्ट सत्यापन की भी आवश्यकता होगी, जिसे इस प्रोटोकॉल में टाला जाता है। एक तरल में वेक्टर जीनोम के प्रसार के कैनेटीक्स के कारण नमूने गर्म होने से पहले पतला हो जाते हैं। हीटिंग और बाद में शीतलन प्रक्रिया के दौरान, एकल-फंसे हुए डीएनए जीनोम के सकारात्मक और नकारात्मक अर्थ किस्में एक डबल-फंसे हुए मध्यवर्ती का उत्पादन करने के लिए एक साथ नष्ट हो सकती हैं यदि सांद्रता पर्याप्त रूप से अधिक है। हीटिंग से पहले कमजोर पड़ने से सांद्रता कम हो जाती है और गणितीय रूप से यह संभावना नहीं होती है कि पर्याप्त डबल-फंसे हुए मध्यवर्ती मात्रा की सटीकता पर प्रतिकूल प्रभाव डालते हैं। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि गुणवत्ता नियंत्रण के रूप में उपयोग किए जाने वाले सिंथेटिक डीएनए टुकड़े या रैखिक प्लास्मिड को इस हीटिंग चरण से नहीं गुजरना चाहिए। चूंकि ये डबल-फंसे हुए हैं, हीटिंग के परिणामस्वरूप एकल-फंसे हुए मध्यवर्ती में रूपांतरण होगा। इन एकल-फंसे हुए क्यूसी को बूंदों में स्वतंत्र रूप से विभाजित करने के बाद, इसके परिणामस्वरूप नाममात्र एकाग्रता के सापेक्ष क्यूसी एकाग्रता में दो गुना वृद्धि होने की उम्मीद होगी। वैकल्पिक रूप से, यदि क्यूसी को विधि को मानकीकृत करने के लिए गर्म किया जाना है, तो इसे नाममात्र एकाग्रता के पुनर्गठन और असाइनमेंट में शामिल किया जाना चाहिए।
अंत में, नमूना तैयार करने के संबंध में, कई प्रोटोकॉल किसी भी अनकैप्सिडेटेड वेक्टर डीएनए को हटाने के लिए डीनेस उपचार चरण को शामिल करने की भी सलाह देते हैं। यह कदम उन मामलों में महत्वपूर्ण है जहां वेक्टर तैयारी से जुड़े मुक्त डीएनए को निर्धारित करना वांछित नहीं है (जैसे कि खुराक उद्देश्यों के लिए परिमाणीकरण के दौरान)। हालांकि, जैव वितरण और बायोशेडिंग अध्ययनों के संदर्भ में, कोई आम तौर पर यह जानना चाहता है कि किसी भी वेक्टर डीएनए ने कहां यात्रा की है, भले ही यह एनकैप्सिटेड हो या नहीं। इसलिए, आमतौर पर ऐसे अध्ययनों के दौरान डीनेस उपचार चरण नहीं करने का सुझाव दिया जाता है। यदि DNase चरण को शामिल करना आवश्यक है, तो यह चरण कमजोर पड़ने और हीटिंग से पहले होना चाहिए।
इस पेपर में, एक फिट-फॉर-उद्देश्य, अच्छे प्रयोगशाला अभ्यास अनुपालन सत्यापन के संदर्भ में विधि की गतिशील सीमा, संवेदनशीलता, सटीकता और परिशुद्धता के आकलन के दृष्टिकोण के डेटा प्रतिनिधि प्रस्तुत किए जाते हैं। इस विषय पर मार्गदर्शन की वर्तमान कमी प्रयोगशालाओं को वर्तमान उद्योग सोच के अनुरूप अपने लिए लक्ष्य परख मानदंड निर्धारित करने के लिए मान्य करती है। विभिन्न समूहों ने इस अध्ययन में उपयोग किए गए उच्च और निम्न लक्ष्य मानदंडदोनों को प्रस्तुत किया है 19,20,21,22,23,24,25। लक्ष्य परख मानदंड, जब तक कि अधिक कठोर रूप से परिभाषित नहीं किया जाता है, विधि के इच्छित नैदानिक अनुप्रयोगों के आधार पर सत्यापन से पहले चुना जाना चाहिए। डेटा के आधार पर किए जाने वाले डाउनस्ट्रीम निर्णयों के आधार पर, सटीकता और परिशुद्धता के उच्च स्तर की आवश्यकता हो सकती है। इसके विपरीत, एक साधारण सकारात्मक बनाम नकारात्मक परिणाम पर्याप्त हो सकता है।
दृष्टिकोण ने विशिष्टता और मैट्रिक्स प्रभाव के आकलन के लिए सिफारिशों को भी संबोधित किया। अनुपचारित व्यक्तियों से एकत्र किए गए आंसुओं का एक पूल इस परख में सकारात्मक परिणाम देने में विफल रहा, जबकि लक्ष्य का पता तब लगाया जा सकता था जब वेक्टर को अनुशंसित वसूली दरों के भीतर उच्च और निम्न सांद्रता पर आंसुओं में बढ़ाया गया था। आदर्श रूप से, अंतर्जात वेक्टर युक्त मैट्रिक्स (उदाहरण के लिए, वायरल वेक्टर के साथ उपचार के बाद एकत्र किया गया) को भी इन आकलनों में शामिल किया जाएगा। हालांकि, यह संभावना नहीं है कि ऐसे नमूने सत्यापन में उपयोग के लिए उपलब्ध होंगे। सत्यापन की मजबूती को बढ़ाने के लिए, विभिन्न व्यक्तियों से एकत्र किए गए आँसू या आँसू के कई पूल का मूल्यांकन यह निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है कि रोगी-विशिष्ट मैट्रिक्स प्रभाव होता है या नहीं। अंत में, स्थिरता का मूल्यांकन करने की सिफारिश की जाती है। वर्कफ़्लोज़ में जहां डीएनए निष्कर्षण जैविक मैट्रिक्स से बाहर होता है, नमूना और निकाले गए डीएनए दोनों की स्थिरता का मूल्यांकन करना आवश्यक हो सकता है। इस वर्कफ़्लो में, डीएनए निष्कर्षण की आवश्यकता के बिना नमूने को सीधे परख में परीक्षण किया जाता है। इसलिए, इस विधि के लिए स्थिरता के मूल्यांकन को ध्यान में रखते हुए, आंसू के नमूनों की स्थिरता का मूल्यांकन करना चाहिए। आमतौर पर, बेंचटॉप, रेफ्रिजरेटर, फ्रीज / पिघलना, और दीर्घकालिक स्थिरता आकलन की सिफारिश की जाती है। ये इस अध्ययन के हिस्से के रूप में नहीं किए गए थे, लेकिन इनपुट नमूनों में जोड़तोड़ के बाद, यहां विकसित तरीकों का उपयोग इस मूल्यांकन में किया जा सकता है।
कुल मिलाकर, इस विधि को आंसू के नमूनों में एएवी-आधारित वैक्टर का पता लगाने के लिए एक मजबूत, दोहराने योग्य और मान्य परख के रूप में प्रदर्शित किया गया है। यह नैदानिक परीक्षणों का समर्थन करने के लिए विशिष्ट वैक्टर के लिए अनुकूलित होने के लिए एक मंच के रूप में काम कर सकता है और अच्छी प्रयोगशाला प्रथाओं के अनुरूप परख के सत्यापन के लिए एक आधार प्रदान करता है।
The authors have nothing to disclose.
हम इस पद्धति के विकास के दौरान उनकी सहायक चर्चाओं के लिए बायो-रैड के निक रसेल और ब्रैंडन मैककेथन को धन्यवाद देना चाहते हैं।
AAV-eGFP Vector | Charles River Laboratories | RS-AAV2-FL | Lot AAV2-0720-FL, used as a proof of principle vector |
AutoDG Droplet Digital PCR system | Bio-Rad | QX200 | Alternative ddPCR system may be used following manufacturer’s protocol. |
AutoDG Oil for Probes | Bio-Rad | 1864110 | Or use material compatible with ddPCR system. |
ddPCR Buffer Control for Probes | Bio-Rad | 1863052 | Or use material compatible with ddPCR system and PCR chemistry. |
ddPCR Droplet Reader Oil | Bio-Rad | 1863004 | Or use material compatible with ddPCR system. |
ddPCR Piercable Foil Seals | Bio-Rad | 1814040 | Or use material compatible with ddPCR system. |
ddPCR Plates 96-Well, Semi-Skirted | Bio-Rad | 12001925 | Or use material compatible with ddPCR system. |
ddPCR Supermix for Probes (no dUTP) | Bio-Rad | 1863023, 1863024, or 1863025 | Use master mix compatible with primers/probes and ddPCR system. |
DG32 AutoDG Cartidges | Bio-Rad | 1864108 | Or use material compatible with ddPCR system. |
Droplet Reader | Bio-Rad | QX200 | Alternative ddPCR system may be used following manufacturer’s protocol. |
GeneAmp PCR Buffer | Applied Biosystems | N8080129 | N/A |
Nuclease-Free Water | Ambion | AM9906 | N/A |
PCR Plate Sealer | Bio-Rad | PX1 | Or use material compatible with ddPCR system. |
Pipet Tips for AutoDG | Bio-Rad | 1864120 | Or use material compatible with ddPCR system. |
Pluronic F-68 Non-ionic Surfactant | Gibco | 24040 | N/A |
Primer and Hydrolysis Probes | Various | Various | Design based on target sequence using general approaches for primer/probe design. Select fluorphores and quenchers compatible with ddPCR system. |
Restriction Enzyme | Various | Various | Varies with target amplification sequence. Use restriction enzyme that does not cut in the amplified sequence |
Sheared salmon sperm DNA | ThermoFisher | AM9680 | N/A |
Synthetic DNA gene fragment or linearized plasmid | Various | Various | Design a synthetic DNA fragment containing the target amplification region for use as a quality control |
TE Buffer | Teknova | T0224 | Ensure prepared or purchases nuclease free. 10 mM Tris-HCl, 1.0 mM EDTA, pH=8.0 |
Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | C1000 | Or use material compatible with ddPCR system. |