Fenêtre stabilisée pour l’imagerie intravitale du pancréas murin

Summary

Nous présentons un protocole pour l’implantation chirurgicale d’une fenêtre optique stabilisée à demeure pour l’imagerie à résolution subcellulaire du pancréas murin, permettant des études en série et longitudinales du pancréas sain et malade.

Abstract

La physiologie et la physiopathologie du pancréas sont complexes. Les maladies du pancréas, telles que la pancréatite et l’adénocarcinome pancréatique (PDAC), ont une morbidité et une mortalité élevées. L’imagerie intravitale (IVI) est une technique puissante permettant l’imagerie à haute résolution des tissus à l’état sain et malade, permettant l’observation en temps réel de la dynamique cellulaire. L’IVI du pancréas murin présente des défis importants en raison de la nature viscérale et souple profonde de l’organe, ce qui le rend très sujet aux dommages et aux artefacts de mouvement.

Le processus d’implantation de l’Indowtabilisé S pourl’imagerie intravitale du Pancréas murin (SWIP) est décrit ici. Le SWIP permet l’IVI du pancréas murin dans des états sains normaux, lors de la transformation du pancréas sain en pancréatite aiguë induite par la céruléine, et dans des états malins tels que les tumeurs pancréatiques. En conjonction avec des cellules génétiquement marquées ou l’administration de colorants fluorescents, le SWIP permet de mesurer la dynamique unicellulaire et subcellulaire (y compris la migration unicellulaire et collective) ainsi que l’imagerie en série d’une même région d’intérêt sur plusieurs jours.

La capacité de capturer la migration des cellules tumorales est particulièrement importante car la principale cause de mortalité liée au cancer dans la PDAC est la charge métastatique écrasante. Comprendre la dynamique physiologique des métastases dans la PDAC est un besoin critique non satisfait et crucial pour améliorer le pronostic des patients. Dans l’ensemble, le SWIP améliore la stabilité de l’imagerie et élargit l’application de l’IVI dans le pancréas sain et les maladies malignes du pancréas.

Introduction

Les maladies bénignes et malignes du pancréas peuvent mettre la vie en danger, avec des lacunes considérables dans la compréhension de leur physiopathologie. La pancréatite, c’est-à-dire l’inflammation du pancréas, est la troisième cause majeure d’hospitalisations et de réadmissions liées aux maladies gastro-intestinales aux États-Unis et est associée à une morbidité, une mortalité et^{un fardeau} socio-économique importants. Classé au troisième rang des causes^{de décès par} cancer2, l’adénocarcinome canalaire pancréatique (PDAC) représente la plupart des tumeurs malignes du pancréas3 et laisse présager un faible taux de survie à 5 ans de seulement 11 %². La principale cause de mortalité liée au cancer chez les ACPE est le fardeau métastatique écrasant. Malheureusement, la plupart des patients présentent une maladie métastatique. Par conséquent, la compréhension de la dynamique des métastases dans l’ACPE est un besoin essentiel non satisfait dans le domaine de la recherche sur le cancer.

Les mécanismes sous-jacents à l’inflammation et à la cascade métastatique du pancréas sont mal compris. L’un des principaux facteurs contribuant à cette lacune dans les connaissances est l’incapacité d’observer la dynamique cellulaire pancréatique in vivo. L’observation directe de ces dynamiques cellulaires promet de révéler des cibles critiques pour tirer parti et améliorer le diagnostic et le traitement des personnes atteintes d’une maladie pancréatique.

L’imagerie intravitale (IVI) est une technique de microscopie qui permet aux chercheurs de visualiser et d’étudier en temps réel les processus biologiques chez les animaux vivants. L’IVI permet une visualisation directe et à haute résolution de la dynamique intracellulaire et microenvironnementale in vivo et dans l’environnement natif du processus biologique en question. Par conséquent, l’IVI permet d’observer in vivo les processus sains et pathologiques.

Les modalités contemporaines d’imagerie du corps entier telles que l’IRM, la TEP et la TDM offrent d’excellentes vues d’organes entiers et peuvent révéler des pathologies, avant même l’apparition des symptômes cliniques⁴. Ils sont cependant incapables d’atteindre une résolution unicellulaire ou de révéler les premiers stades de la maladie, la pancréatite ou la malignité.

Des recherches antérieures ont utilisé l’IVI à résolution unicellulaire pour observer les maladies bénignes et malignes de la peau^5,6, du sein⁷, du poumon⁸, du foie⁹, du cerveau 10 et des tumeurs pancréatiques 11^, ce qui a permis de mieux comprendre les mécanismes de progression de la maladie ¹². Cependant, le pancréas murin pose des obstacles importants à l’obtention d’une résolution unicellulaire à l’aide de l’IVI, principalement en raison de sa localisation viscérale profonde et de sa grande observance. De plus, il s’agit d’un organe ramifié et distribué de manière diffuse dans le mésentère qui se connecte à la rate, à l’intestin grêle et à l’estomac, ce qui le rend difficile d’accès. Le tissu est également très sensible aux mouvements causés par le péristaltisme et la respiration adjacents. La minimisation des mouvements du pancréas est essentielle pour la microscopie à résolution de cellule unique, car les artefacts de mouvement, même de quelques microns, peuvent brouiller et déformer les images, ce qui rend impossible le suivi de la dynamique des cellules individuelles¹³.

Pour réaliser une IVI, une fenêtre d’imagerie abdominale (AIW) doit être implantée chirurgicalement ^9,11. Pour implanter l’AIW chirurgicalement, un cadre de fenêtre métallique est suturé dans la paroi abdominale. Ensuite, l’organe d’intérêt est fixé au cadre à l’aide d’un adhésif cyanoacrylate. Bien que cela soit suffisant pour certains organes internes rigides (par exemple, le foie, la rate, les tumeurs rigides), les tentatives d’imagerie du pancréas murin sain sont compromises par une stabilité latérale et axiale sous-optimale en raison de la texture souple et de l’architecture complexe du tissu¹⁴. Pour remédier à cette limitation, Park et ^al.14 ont mis au point une fenêtre d’imagerie spécialement conçue pour le pancréas sain. Cette fenêtre d’imagerie du pancréas (PIW) minimise l’influence des mouvements intestinaux et de la respiration en incorporant une étagère métallique horizontale dans le cadre de la fenêtre, juste en dessous de la lamelle, stabilisant le tissu et maintenant son contact avec la vitre de protection. Bien que le PIW offre une stabilité latérale accrue, nous avons constaté que cette fenêtre présente toujours une dérive axiale et empêche en outre l’imagerie de grosses tumeurs solides en raison de l’espace étroit entre l’étagère métallique et la lamelle¹⁵.

Pour remédier à ces limitations, nous avons mis au point le Window tabilisé Spour l’imagerie intravitale du pancréasmurin (SWIP), une fenêtre d’imagerie implantable capable d’obtenir une imagerie stable à long terme du pancréas sain et malade (Figure 1)¹⁵. Ici, nous fournissons un protocole complet pour l’intervention chirurgicale utilisée pour implanter le SWIP. Bien que l’objectif principal ait été d’étudier les mécanismes dynamiques impliqués dans les métastases, cette méthode peut également être utilisée pour explorer divers aspects de la biologie et de la pathologie du pancréas.

Protocol

Toutes les procédures décrites dans ce protocole ont été effectuées conformément aux directives et aux règlements pour l’utilisation d’animaux vertébrés, y compris l’approbation préalable du comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Albert Einstein College of Medicine. 1. Passivation des fenêtres REMARQUE : La passivation de l’acier inoxydable nettoie le métal des contaminants et crée une fine …

Representative Results

La figure 1, adaptée de Du et al.15, montre des images fixes d’un film IVI en accéléré du pancréas murin. Certains mouvements tissulaires peuvent être observés au cours de la période initiale de décantation (première heure d’imagerie, Figure 1A). Cependant, avec la poursuite de l’imagerie après cette période de stabilisation (>75 min), nous avons observé une augmentation de la stabilité latérale et axiale (<strong cla…

Discussion

Le protocole SWIP décrit ici fournit une méthode améliorée de stabilisation du tissu pancréatique en utilisant une technique de panier au point de croix. Les premières fenêtres d’imagerie abdominale (AIW) permettaient l’imagerie intravitale (IVI) des organes internes de l’abdomen, mais ne limitaient pas adéquatement le mouvement des tissus mous tels que le pancréas. En réponse, Park et al. ont mis au point une fenêtre d’imagerie du pancréas (PIW) qui intègre une étagère métallique horizontale et p…

Materials

1% (w/v) solution of enzyme-active detergent	Alconox Inc	NA	Concentrated, anionic detergent with protease enzymes for manual and ultrasonic cleaning
5% (w/v) solution of sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045	Passivation reagent
5 mm cover glass	Electron Microscopy Sciences	72296-05	Round Glass Coverslips
7% (w/v) solution of citric acid	Sigma-Aldrich	251275	Passivation reagent
28G 1 mL BD Insulin Syringe	BD	329410	Syringe for cell injection
Baytril 100 (enrofloxacin)	Bayer (Santa Cruz Biotechnology)	sc-362890Rx	Antibiotic
Bench Mount Heat Lamp	McMaster-Carr	3349K51	Heat lamp
Buprenorphine 0.3 mg/mL	Covetrus North America	059122	Buprenorphine Analgesia
Castroviejo Curved Scissors	World Precision Instruments	WP2220	Scissor for cutting tissue
C57BL/6J Mouse	Jackson Laboratory	000664	C57BL/6J Mouse
Chlorhexidine solution	Durvet	7-45801-10258-3	Chlorhexidine Disinfectant Solution
Compressed air canister	Falcon	DPSJB-12	Compressed air for drying tissue
Cyano acrylate – Gel Superglue	Staples	234790-6	Skin Glue
Cyano acrylate – Liquid Superglue	Staples	LOC1647358	Coverslip Glue
DPBS 1x	Corning	21-031-CV	DPBS for cerulein/cell injections
Gemini Cautery Kit	Harvard Apparatus	726067	Cautery Pen
Germinator 500	CellPoint Scientific	GER 5287-120V	Bead Sterilizer
Graefe Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length	Roboz Surgical	RS-5135	Graefe Micro Dissecting Forceps
Imaging microscope	NA	NA	See Entenberg et al. 2011 [27]
Imaging software	NA	NA	See Entenberg et al. 2011 [27]
Isoethesia (isoflurane)	Henry Schein Animal Health	50033	Isoflurane Anesthesia
Kim Wipes	Fisher Scientific	06-666-A	Kim Wipes
Laboratory tape	Fisher Scientific	159015R	Laboratory Tape
Mouse Dissecting Kit	World Precision Instruments	MOUSEKIT	Surgical Instruments
Mouse Paw Pulse Oximeter Sensor	Kent Scientific Corpo	MSTAT Sensor-MSE	Pulse Oximeter
Mouse Surgisuite	Kent Scientific	SURGI-M04	Heated platform
Nair Hair Removal Lotion	Amazon	B001RVMR7K	Depilatory Lotion
Oxygen	TechAir	OX TM	Oxygen
PERMA-HAND Black Braided Silk Sutures, ETHICON Size 5-0	VWR	95056-872	Silk Suture
Phosphate Buffered Saline 1x	Life Technologies	10010-023	PBS
PhysioSuite System	Kent Scientific	PhysioSuite	Heated Platform Controller
Puralube	Henry Schein Animal Health	008897	Eye Lubricant
Puritan Nonsterile Cotton-Tipped Swabs	Fisher Scientific	867WCNOGLUE	Cotton Swabs
SHARP Precision Barrier Tips, For P-100, 100 µL	Denville Scientific Inc.	P1125	100 µL Pipet Tips
Tetramethylrhodamine isothiocyanate–Dextran	Sigma-Aldrich	T1287-500MG	Vascular Label
Window-fixturing plate	NA	NA	Custom made plate for window placement on microscope stage. Plate is made of 0.008 in stainless steel shim stock. For dimensions of plate see Entenberg et al., 2018 [8].
Window Frame	NA	NA	The window is composed of a steel frame with a central aperture that accepts a 5 mm coverslip. A groove of 1.75 mm around the circumference of the frame provides space for the peritoneal muscle and skin layers to adhere to. See Entenberg et al., 2018 [8].