Finestra stabilizzata per l'imaging intravitale del pancreas murino

Summary

Presentiamo un protocollo per l’impianto chirurgico di una finestra ottica stabilizzata a permanenza per l’imaging a risoluzione subcellulare del pancreas murino, consentendo studi seriali e longitudinali del pancreas sano e malato.

Abstract

La fisiologia e la fisiopatologia del pancreas sono complesse. Le malattie del pancreas, come la pancreatite e l’adenocarcinoma pancreatico (PDAC), hanno un’elevata morbilità e mortalità. L’imaging intravitale (IVI) è una potente tecnica che consente l’imaging ad alta risoluzione di tessuti sia in condizioni sane che malate, consentendo l’osservazione in tempo reale delle dinamiche cellulari. L’IVI del pancreas murino presenta sfide significative a causa della natura viscerale profonda e cedevole dell’organo, che lo rende altamente soggetto a danni e artefatti da movimento.

Di seguito è descritto il processo di impianto del P increasmurino (SWIP). Lo SWIP consente l’IVI del pancreas murino in stati di salute normali, durante la trasformazione dal pancreas sano a pancreatite acuta indotta da ceruleina, e in stati maligni come i tumori pancreatici. In combinazione con cellule geneticamente marcate o con la somministrazione di coloranti fluorescenti, lo SWIP consente la misurazione delle dinamiche a singola cellula e subcellulare (compresa la migrazione a singola cellula e collettiva), nonché l’imaging seriale della stessa regione di interesse per più giorni.

La capacità di catturare la migrazione delle cellule tumorali è di particolare importanza in quanto la causa primaria di mortalità correlata al cancro nel PDAC è il carico metastatico schiacciante. Comprendere le dinamiche fisiologiche delle metastasi nel PDAC è un’esigenza critica insoddisfatta e cruciale per migliorare la prognosi del paziente. Nel complesso, lo SWIP fornisce una migliore stabilità dell’imaging ed espande l’applicazione dell’IVI nelle malattie sane del pancreas e del pancreas maligno.

Introduction

Le malattie pancreatiche benigne e maligne sono potenzialmente pericolose per la vita, con notevoli lacune nella comprensione della loro fisiopatologia. La pancreatite, l’infiammazione del pancreas, è la terza causa principale di ricoveri ospedalieri e riammissioni correlati a malattie gastrointestinali negli Stati Uniti ed è associata a morbilità, mortalità e onere socioeconomico^sostanziali. Classificato come la terza causa di morte correlata al cancro 2, l’adenocarcinoma duttale pancreatico (PDAC) rappresenta la maggior parte delle neoplasie pancreatiche³ e fa presagire uno scarso tasso di sopravvivenza a 5 anni di solo l’11%². La principale causa di mortalità correlata al cancro nel PDAC è il carico metastatico schiacciante. Sfortunatamente, la maggior parte dei pazienti presenta una malattia metastatica. Pertanto, la comprensione delle dinamiche delle metastasi nel PDAC è un’esigenza critica insoddisfatta nel campo della ricerca sul cancro.

I meccanismi alla base dell’infiammazione e della cascata metastatica del pancreas sono poco conosciuti. Uno dei principali fattori che contribuiscono a questa lacuna nella conoscenza è l’incapacità di osservare le dinamiche cellulari pancreatiche in vivo. L’osservazione diretta di queste dinamiche cellulari promette di svelare bersagli critici per sfruttare e migliorare la diagnosi e il trattamento delle persone affette da malattie pancreatiche.

L’imaging intravitale (IVI) è una tecnica di microscopia che consente ai ricercatori di visualizzare e studiare i processi biologici negli animali viventi in tempo reale. IVI consente la visualizzazione diretta ad alta risoluzione delle dinamiche intracellulari e microambientali in vivo e all’interno dell’ambiente nativo del processo biologico in questione. Pertanto, l’IVI consente l’osservazione in vivo di processi sani e patologici.

Le moderne modalità di imaging di tutto il corpo come la risonanza magnetica, la PET e la TC offrono un’eccellente visione di interi organi e possono rivelare patologie, anche prima dell’insorgenza dei sintomi clinici⁴. Non sono in grado, tuttavia, di raggiungere la risoluzione di una singola cellula o di rivelare i primi stadi della malattia-pancreatite o neoplasia.

Ricerche precedenti hanno utilizzato l’IVI a risoluzione singola cellulare per osservare malattie benigne e maligne della pelle^5,6, della mammella⁷, del polmone⁸, del fegato⁹, del cervello 10 e dei tumori pancreatici 11^, portando a intuizioni sui meccanismi di progressione della malattia ¹². Tuttavia, il pancreas murino pone ostacoli significativi al raggiungimento della risoluzione di una singola cellula utilizzando IVI, principalmente a causa della sua posizione viscerale profonda e dell’elevata compliance. Inoltre, è un organo ramificato e diffusamente distribuito all’interno del mesentere che si collega alla milza, all’intestino tenue e allo stomaco, rendendolo di difficile accesso. Il tessuto è anche altamente sensibile al movimento causato dalla peristalsi e dalla respirazione adiacenti. Ridurre al minimo il movimento del pancreas è essenziale per la microscopia a risoluzione di una singola cellula, poiché artefatti da movimento anche di pochi micron possono sfocare e distorcere le immagini, rendendo impossibile il tracciamento della dinamica delle singole cellule¹³.

Per eseguire l’IVI, è necessario impiantare chirurgicamente una finestra di imaging addominale (AIW) ^9,11. Per impiantare chirurgicamente l’AIW, un telaio metallico della finestra viene suturato nella parete addominale. Successivamente, l’organo di interesse viene fissato al telaio utilizzando un adesivo cianoacrilato. Mentre questo è sufficiente per alcuni organi interni rigidi (ad esempio, fegato, milza, tumori rigidi), i tentativi di imaging del pancreas murino sano sono compromessi da una stabilità laterale e assiale non ottimale a causa della struttura conforme del tessuto e dell’architettura complessa¹⁴. Per affrontare questa limitazione, Park et ^al.14 hanno sviluppato una finestra di imaging specificamente progettata per il pancreas sano. Questa finestra per imaging del pancreas (PIW) riduce al minimo l’influenza del movimento intestinale e della respirazione incorporando un ripiano metallico orizzontale all’interno del telaio della finestra, appena sotto il vetrino coprioggetto, stabilizzando il tessuto e mantenendo il contatto con il vetro di copertura. Sebbene il PIW offra una maggiore stabilità laterale, abbiamo scoperto che questa finestra mostra ancora una deriva assiale e impedisce inoltre l’imaging di tumori solidi di grandi dimensioni a causa dello stretto spazio tra il ripiano metallico e il vetrino coprioggetto¹⁵.

Per ovviare a queste limitazioni, abbiamo sviluppato il Window tabilizzato a Sper l’imagingI ntravitale del Pancreas murino (SWIP), una finestra di imaging impiantabile in grado di ottenere un imaging stabile a lungo termine sia del pancreas sano che di quello malato (Figura 1)¹⁵. Qui forniamo un protocollo completo per la procedura chirurgica utilizzata per impiantare lo SWIP. Sebbene l’obiettivo primario fosse quello di studiare i meccanismi dinamici coinvolti nelle metastasi, questo metodo può essere utilizzato anche per esplorare vari aspetti della biologia e della patologia del pancreas.

Protocol

Tutte le procedure descritte in questo protocollo sono state eseguite in conformità con le linee guida e i regolamenti per l’uso di animali vertebrati, inclusa la previa approvazione da parte dell’Albert Einstein College of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). 1. Passivazione delle finestre NOTA: La passivazione dell’acciaio inossidabile pulisce il metallo dai contaminanti e crea un sottile strato di ossido che aumenta notevo…

Representative Results

La Figura 1, adattata da Du et al.15, mostra immagini fisse da un filmato IVI time-lapse del pancreas murino. È possibile osservare un certo movimento dei tessuti durante il periodo di assestamento iniziale (prima ora di imaging, Figura 1A). Tuttavia, con l’imaging continuato dopo questo periodo di assestamento (>75 min), abbiamo osservato un aumento della stabilità laterale e assiale (Figura 1B). Il confro…

Discussion

Il protocollo SWIP qui descritto fornisce un metodo migliorato di stabilizzazione del tessuto pancreatico utilizzando una tecnica a punto croce. Le finestre di imaging addominale precoce (AIW) hanno consentito l’imaging intravitale (IVI) degli organi interni dell’addome, ma non hanno limitato adeguatamente il movimento dei tessuti molli come il pancreas. In risposta, Park et al. hanno sviluppato una finestra di imaging del pancreas (PIW) che incorpora un ripiano metallico orizzontale e consente una migliore stabilizzazio…

Materials

1% (w/v) solution of enzyme-active detergent	Alconox Inc	NA	Concentrated, anionic detergent with protease enzymes for manual and ultrasonic cleaning
5% (w/v) solution of sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045	Passivation reagent
5 mm cover glass	Electron Microscopy Sciences	72296-05	Round Glass Coverslips
7% (w/v) solution of citric acid	Sigma-Aldrich	251275	Passivation reagent
28G 1 mL BD Insulin Syringe	BD	329410	Syringe for cell injection
Baytril 100 (enrofloxacin)	Bayer (Santa Cruz Biotechnology)	sc-362890Rx	Antibiotic
Bench Mount Heat Lamp	McMaster-Carr	3349K51	Heat lamp
Buprenorphine 0.3 mg/mL	Covetrus North America	059122	Buprenorphine Analgesia
Castroviejo Curved Scissors	World Precision Instruments	WP2220	Scissor for cutting tissue
C57BL/6J Mouse	Jackson Laboratory	000664	C57BL/6J Mouse
Chlorhexidine solution	Durvet	7-45801-10258-3	Chlorhexidine Disinfectant Solution
Compressed air canister	Falcon	DPSJB-12	Compressed air for drying tissue
Cyano acrylate – Gel Superglue	Staples	234790-6	Skin Glue
Cyano acrylate – Liquid Superglue	Staples	LOC1647358	Coverslip Glue
DPBS 1x	Corning	21-031-CV	DPBS for cerulein/cell injections
Gemini Cautery Kit	Harvard Apparatus	726067	Cautery Pen
Germinator 500	CellPoint Scientific	GER 5287-120V	Bead Sterilizer
Graefe Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length	Roboz Surgical	RS-5135	Graefe Micro Dissecting Forceps
Imaging microscope	NA	NA	See Entenberg et al. 2011 [27]
Imaging software	NA	NA	See Entenberg et al. 2011 [27]
Isoethesia (isoflurane)	Henry Schein Animal Health	50033	Isoflurane Anesthesia
Kim Wipes	Fisher Scientific	06-666-A	Kim Wipes
Laboratory tape	Fisher Scientific	159015R	Laboratory Tape
Mouse Dissecting Kit	World Precision Instruments	MOUSEKIT	Surgical Instruments
Mouse Paw Pulse Oximeter Sensor	Kent Scientific Corpo	MSTAT Sensor-MSE	Pulse Oximeter
Mouse Surgisuite	Kent Scientific	SURGI-M04	Heated platform
Nair Hair Removal Lotion	Amazon	B001RVMR7K	Depilatory Lotion
Oxygen	TechAir	OX TM	Oxygen
PERMA-HAND Black Braided Silk Sutures, ETHICON Size 5-0	VWR	95056-872	Silk Suture
Phosphate Buffered Saline 1x	Life Technologies	10010-023	PBS
PhysioSuite System	Kent Scientific	PhysioSuite	Heated Platform Controller
Puralube	Henry Schein Animal Health	008897	Eye Lubricant
Puritan Nonsterile Cotton-Tipped Swabs	Fisher Scientific	867WCNOGLUE	Cotton Swabs
SHARP Precision Barrier Tips, For P-100, 100 µL	Denville Scientific Inc.	P1125	100 µL Pipet Tips
Tetramethylrhodamine isothiocyanate–Dextran	Sigma-Aldrich	T1287-500MG	Vascular Label
Window-fixturing plate	NA	NA	Custom made plate for window placement on microscope stage. Plate is made of 0.008 in stainless steel shim stock. For dimensions of plate see Entenberg et al., 2018 [8].
Window Frame	NA	NA	The window is composed of a steel frame with a central aperture that accepts a 5 mm coverslip. A groove of 1.75 mm around the circumference of the frame provides space for the peritoneal muscle and skin layers to adhere to. See Entenberg et al., 2018 [8].