Ventana estabilizada para la obtención de imágenes intravitales del páncreas murino
Summary
Presentamos un protocolo para la implantación quirúrgica de una ventana óptica permanente estabilizada para la obtención de imágenes de resolución subcelular del páncreas murino, que permite realizar estudios seriados y longitudinales del páncreas sano y enfermo.
Abstract
La fisiología y la fisiopatología del páncreas son complejas. Las enfermedades del páncreas, como la pancreatitis y el adenocarcinoma de páncreas (PDAC, por sus siglas en inglés) tienen una alta morbilidad y mortalidad. La obtención de imágenes intravitales (IVI) es una técnica potente que permite obtener imágenes de alta resolución de tejidos tanto en estado sano como enfermo, lo que permite observar en tiempo real la dinámica celular. La IVI del páncreas murino presenta desafíos significativos debido a la naturaleza visceral profunda y distensible del órgano, lo que lo hace muy propenso a daños y artefactos de movimiento.
Aquí se describe el proceso de implantación de la Window Stabilizada para laobtención de imágenes intravitales de las Pancreas murinas (SWIP). El SWIP permite la IVI del páncreas murino en estados normales de salud, durante la transformación del páncreas sano a pancreatitis aguda inducida por ceruleína, y en estados malignos como los tumores pancreáticos. Junto con células marcadas genéticamente o la administración de colorantes fluorescentes, el SWIP permite la medición de la dinámica de una sola célula y subcelular (incluida la migración unicelular y colectiva), así como la obtención de imágenes en serie de la misma región de interés durante varios días.
La capacidad de capturar la migración de las células tumorales es de particular importancia, ya que la causa principal de mortalidad relacionada con el cáncer en el PDAC es la abrumadora carga metastásica. La comprensión de la dinámica fisiológica de la metástasis en el PDAC es una necesidad crítica no satisfecha y crucial para mejorar el pronóstico del paciente. En general, el SWIP proporciona una mejor estabilidad de la imagen y amplía la aplicación de IVI en el páncreas sano y las enfermedades malignas del páncreas.
Introduction
Las enfermedades pancreáticas benignas y malignas son potencialmente mortales, con lagunas considerables en la comprensión de su fisiopatología. La pancreatitis (inflamación del páncreas) es la tercera causa principal de ingresos y reingresos hospitalarios relacionados con enfermedades gastrointestinales en los EE. UU. y se asocia con una morbilidad, mortalidady carga socioeconómica sustanciales. Clasificado como la tercera causa principal de muerte relacionada con el cáncer 2, el adenocarcinoma ductal de páncreas (PDAC) representa la mayoría de las neoplasias malignas de páncreas3 y presagia una baja tasa de supervivencia a 5 años de solo el 11 %2. La principal causa de mortalidad relacionada con el cáncer en el PDAC es la abrumadora carga metastásica. Desafortunadamente, la mayoría de los pacientes presentan enfermedad metastásica. Por lo tanto, la comprensión de la dinámica de la metástasis en el PDAC es una necesidad crítica no satisfecha en el campo de la investigación del cáncer.
Los mecanismos que sustentan la inflamación y la cascada metastásica del páncreas son poco conocidos. Uno de los principales factores que contribuyen a esta brecha de conocimiento es la incapacidad de observar la dinámica celular pancreática in vivo. La observación directa de estas dinámicas celulares promete revelar objetivos críticos para aprovechar y mejorar el diagnóstico y el tratamiento de las personas con enfermedad pancreática.
La imagen intravital (IVI) es una técnica de microscopía que permite a los investigadores visualizar y estudiar los procesos biológicos en animales vivos en tiempo real. IVI permite la visualización directa y de alta resolución de la dinámica intracelular y microambiental in vivo y dentro del entorno nativo del proceso biológico en cuestión. Por lo tanto, IVI permite la observación in vivo de procesos sanos y patológicos.
Las modalidades contemporáneas de imágenes de cuerpo entero, como la resonancia magnética, la tomografía por emisión de positrones y la tomografía computarizada, ofrecen excelentes vistas de órganos completos y pueden revelar patologías, incluso antes de la aparición de los síntomas clínicos4. Sin embargo, no son capaces de lograr una resolución de una sola célula o revelar las primeras etapas de la enfermedad: pancreatitis o neoplasia maligna.
Investigaciones anteriores han utilizado IVI de resolución unicelular para observar enfermedades benignas y malignas de la piel5,6, la mama7, el pulmón8, el hígado9, el cerebro 10 y los tumores pancreáticos 11, lo que ha llevado a comprender los mecanismos de progresión de la enfermedad 12. Sin embargo, el páncreas murino presenta obstáculos significativos para lograr la resolución de una sola célula mediante IVI, principalmente debido a su ubicación visceral profunda y su alta distensibilidad. Además, es un órgano ramificado y de distribución difusa dentro del mesenterio que se conecta con el bazo, el intestino delgado y el estómago, lo que dificulta su acceso. El tejido también es muy sensible al movimiento causado por el peristaltismo adyacente y la respiración. Minimizar el movimiento del páncreas es esencial para la microscopía de resolución unicelular, ya que los artefactos de movimiento de incluso unas pocas micras pueden desenfocar y distorsionar las imágenes, lo quehace imposible el seguimiento de la dinámica de las células individuales.
Para la realización de la IVI se debe implantar quirúrgicamente una ventana de imagen abdominal (AIW) 9,11. Para implantar quirúrgicamente el AIW, se sutura un marco de ventana de metal en la pared abdominal. Posteriormente, el órgano de interés se fija al marco mediante adhesivo de cianoacrilato. Si bien esto es suficiente para algunos órganos internos rígidos (p. ej., hígado, bazo, tumores rígidos), los intentos de obtener imágenes del páncreas murino sano se ven comprometidos por una estabilidad lateral y axial subóptima debido a la textura dócil del tejido y a la arquitectura compleja14. Para hacer frente a esta limitación, Park et al.14 desarrollaron una ventana de imagen diseñada específicamente para el páncreas sano. Esta ventana de imágenes de páncreas (PIW) minimiza la influencia del movimiento intestinal y la respiración al incorporar un estante metálico horizontal dentro del marco de la ventana, justo debajo del cubreobjetos, estabilizando el tejido y manteniendo su contacto con el cubreobjetos. Si bien el PIW ofrece una mayor estabilidad lateral, descubrimos que esta ventana aún muestra deriva axial y, además, evita la obtención de imágenes de tumores sólidos grandes debido al estrecho espacio entre el estante metálico y el cubreobjetos15.
Para hacer frente a estas limitaciones, desarrollamos el Window Stabilizado para laobtención de imágenes intravitales de las Páncreasmurinas (SWIP), una ventana de imagen implantable capaz de lograr una imagen estable a largo plazo tanto del páncreas sano como del enfermo (Figura 1)15. Aquí, proporcionamos un protocolo completo para el procedimiento quirúrgico utilizado para implantar el SWIP. Aunque el objetivo principal era estudiar los mecanismos dinámicos implicados en la metástasis, este método también puede utilizarse para explorar diversos aspectos de la biología y la patología del páncreas.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo SWIP descrito aquí proporciona un método mejorado de estabilización del tejido pancreático mediante la utilización de una técnica de canasta de punto de cruz. Las primeras ventanas de imágenes abdominales (AIW, por sus siglas en inglés) permitieron la obtención de imágenes intravitales (IVI, por sus siglas en inglés) de los órganos internos del abdomen, pero no limitaron adecuadamente el movimiento de los tejidos blandos, como el páncreas. En respuesta, Park et al. desarrollaron una ventana de i…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La Fundación Benéfica Evelyn Lipper, el Centro de Biofotónica Gruss-Lipper, el Programa Integrado de Imágenes para la Investigación del Cáncer, una beca T-32 de los NIH (CA200561) y una subvención del Programa de Investigación del Cáncer de Páncreas (PCARP) del Departamento de Defensa PA210223P1.
Materials
| 1% (w/v) solution of enzyme-active detergent | Alconox Inc | NA | Concentrated, anionic detergent with protease enzymes for manual and ultrasonic cleaning |
| 5% (w/v) solution of sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | Passivation reagent |
| 5 mm cover glass | Electron Microscopy Sciences | 72296-05 | Round Glass Coverslips |
| 7% (w/v) solution of citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | Passivation reagent |
| 28G 1 mL BD Insulin Syringe | BD | 329410 | Syringe for cell injection |
| Baytril 100 (enrofloxacin) | Bayer (Santa Cruz Biotechnology) | sc-362890Rx | Antibiotic |
| Bench Mount Heat Lamp | McMaster-Carr | 3349K51 | Heat lamp |
| Buprenorphine 0.3 mg/mL | Covetrus North America | 059122 | Buprenorphine Analgesia |
| Castroviejo Curved Scissors | World Precision Instruments | WP2220 | Scissor for cutting tissue |
| C57BL/6J Mouse | Jackson Laboratory | 000664 | C57BL/6J Mouse |
| Chlorhexidine solution | Durvet | 7-45801-10258-3 | Chlorhexidine Disinfectant Solution |
| Compressed air canister | Falcon | DPSJB-12 | Compressed air for drying tissue |
| Cyano acrylate – Gel Superglue | Staples | 234790-6 | Skin Glue |
| Cyano acrylate – Liquid Superglue | Staples | LOC1647358 | Coverslip Glue |
| DPBS 1x | Corning | 21-031-CV | DPBS for cerulein/cell injections |
| Gemini Cautery Kit | Harvard Apparatus | 726067 | Cautery Pen |
| Germinator 500 | CellPoint Scientific | GER 5287-120V | Bead Sterilizer |
| Graefe Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length | Roboz Surgical | RS-5135 | Graefe Micro Dissecting Forceps |
| Imaging microscope | NA | NA | See Entenberg et al. 2011 [27] |
| Imaging software | NA | NA | See Entenberg et al. 2011 [27] |
| Isoethesia (isoflurane) | Henry Schein Animal Health | 50033 | Isoflurane Anesthesia |
| Kim Wipes | Fisher Scientific | 06-666-A | Kim Wipes |
| Laboratory tape | Fisher Scientific | 159015R | Laboratory Tape |
| Mouse Dissecting Kit | World Precision Instruments | MOUSEKIT | Surgical Instruments |
| Mouse Paw Pulse Oximeter Sensor | Kent Scientific Corpo | MSTAT Sensor-MSE | Pulse Oximeter |
| Mouse Surgisuite | Kent Scientific | SURGI-M04 | Heated platform |
| Nair Hair Removal Lotion | Amazon | B001RVMR7K | Depilatory Lotion |
| Oxygen | TechAir | OX TM | Oxygen |
| PERMA-HAND Black Braided Silk Sutures, ETHICON Size 5-0 | VWR | 95056-872 | Silk Suture |
| Phosphate Buffered Saline 1x | Life Technologies | 10010-023 | PBS |
| PhysioSuite System | Kent Scientific | PhysioSuite | Heated Platform Controller |
| Puralube | Henry Schein Animal Health | 008897 | Eye Lubricant |
| Puritan Nonsterile Cotton-Tipped Swabs | Fisher Scientific | 867WCNOGLUE | Cotton Swabs |
| SHARP Precision Barrier Tips, For P-100, 100 µL | Denville Scientific Inc. | P1125 | 100 µL Pipet Tips |
| Tetramethylrhodamine isothiocyanate–Dextran | Sigma-Aldrich | T1287-500MG | Vascular Label |
| Window-fixturing plate | NA | NA | Custom made plate for window placement on microscope stage. Plate is made of 0.008 in stainless steel shim stock. For dimensions of plate see Entenberg et al., 2018 [8]. |
| Window Frame | NA | NA | The window is composed of a steel frame with a central aperture that accepts a 5 mm coverslip. A groove of 1.75 mm around the circumference of the frame provides space for the peritoneal muscle and skin layers to adhere to. See Entenberg et al., 2018 [8]. |
Referências
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