Murin Pankreasın İntravital Görüntülenmesi için Stabilize Pencere
Summary
Sağlıklı ve hastalıklı pankreasın seri ve uzunlamasına çalışmalarına izin veren, murin pankreasın hücre altı çözünürlüklü görüntülenmesi için stabilize kalıcı bir optik pencerenin cerrahi implantasyonu için bir protokol sunuyoruz.
Abstract
Pankreasın fizyolojisi ve patofizyolojisi karmaşıktır. Pankreatit ve pankreas adenokarsinomu (PDAC) gibi pankreas hastalıkları yüksek morbidite ve mortaliteye sahiptir. İntravital görüntüleme (IVI), hem sağlıklı hem de hastalıklı durumlarda dokuların yüksek çözünürlüklü görüntülenmesini sağlayan ve hücre dinamiklerinin gerçek zamanlı olarak gözlemlenmesini sağlayan güçlü bir tekniktir. Murin pankreasın IVI’si, organın derin içgüdüsel ve uyumlu doğası nedeniyle önemli zorluklar sunar, bu da onu hasara ve hareket artefaktlarına oldukça yatkın hale getirir.
Burada tarif edilen, murin Pankreasın (SWIP) I’ninntravital görüntülemesi için Stabilize Window’un implantasyon sürecidir. SWIP, normal sağlıklı durumlarda, sağlıklı pankreastan serulein tarafından indüklenen akut pankreatite dönüşüm sırasında ve pankreas tümörleri gibi malign durumlarda murin pankreasın IVI’sine izin verir. Genetik olarak etiketlenmiş hücreler veya floresan boyaların uygulanması ile bağlantılı olarak SWIP, tek hücreli ve hücre altı dinamiklerin (tek hücreli ve toplu göç dahil) ölçülmesini ve aynı ilgilenilen bölgenin birkaç gün boyunca seri görüntülenmesini sağlar.
PDAC’de kansere bağlı mortalitenin birincil nedeni ezici metastatik yük olduğundan, tümör hücresi göçünü yakalama yeteneği özellikle önemlidir. PDAC’de metastazın fizyolojik dinamiklerini anlamak, karşılanmamış kritik bir ihtiyaçtır ve hasta prognozunu iyileştirmek için çok önemlidir. Genel olarak, SWIP gelişmiş görüntüleme stabilitesi sağlar ve sağlıklı pankreas ve malign pankreas hastalıklarında IVI uygulamasını genişletir.
Introduction
İyi huylu ve kötü huylu pankreas hastalıkları potansiyel olarak yaşamı tehdit eder ve patofizyolojilerinin anlaşılmasında önemli boşluklar vardır. Pankreatit – pankreas iltihabı – ABD’de gastrointestinal hastalığa bağlı hastaneye yatışların ve yeniden kabullerin üçüncü ana nedenidir ve önemli morbidite, mortalite ve sosyoekonomik yük ile ilişkilidir1. Kansere bağlı ölümlerin üçüncü önde gelen nedeni2 olarak sıralanan pankreas duktal adenokarsinomu (PDAC), çoğu pankreas malignitesini3 oluşturur ve sadece %11’lik kötü bir 5 yıllık sağkalım oranına işaret eder2. PDAC’de kansere bağlı mortalitenin önde gelen nedeni ezici metastatik yüktür. Ne yazık ki, çoğu hasta metastatik hastalık ile başvurur. Bu nedenle, PDAC’de metastaz dinamiklerini anlamak, kanser araştırmaları alanında karşılanmamış kritik bir ihtiyaçtır.
Enflamasyonu ve pankreasın metastatik kaskadını destekleyen mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır. Bilgideki bu boşluğa önemli bir katkı, pankreas hücresel dinamiklerini in vivo olarak gözlemleyememektir. Bu hücresel dinamiklerin doğrudan gözlemlenmesi, pankreas hastalığı olanların tanı ve tedavisini güçlendirmek ve iyileştirmek için kritik hedefleri ortaya çıkarmayı vaat ediyor.
İntravital görüntüleme (IVI), araştırmacıların canlı hayvanlardaki biyolojik süreçleri gerçek zamanlı olarak görselleştirmesine ve incelemesine olanak tanıyan bir mikroskopi tekniğidir. IVI, hücre içi ve mikroçevresel dinamiklerin in vivo ve söz konusu biyolojik sürecin doğal ortamında yüksek çözünürlüklü, doğrudan görselleştirilmesine izin verir. Bu nedenle IVI, sağlıklı ve patolojik süreçlerin in vivo olarak gözlemlenmesine izin verir.
MRI, PET ve BT gibi çağdaş tüm vücut görüntüleme yöntemleri, tüm organların mükemmel görüntülerini sunar ve klinik semptomların başlamasından önce bile patolojileri ortaya çıkarabilir4. Bununla birlikte, tek hücreli çözünürlüğe ulaşamazlar veya hastalık-pankreatit veya malignitenin en erken aşamalarını ortaya çıkaramazlar.
Önceki araştırmalar, cilt5,6, meme7, akciğer 8, karaciğer9, beyin 10 ve pankreas tümörlerinin 11 iyi huylu ve kötü huylu hastalıklarını gözlemlemek için tek hücreli çözünürlük IVI kullanmış ve hastalığın ilerleme mekanizmalarına ilişkin içgörülere yol açmıştır 12. Bununla birlikte, murin pankreası, öncelikle derin viseral konumu ve yüksek uyumu nedeniyle, IVI kullanarak tek hücreli çözünürlüğe ulaşmada önemli engeller oluşturmaktadır. Ayrıca, mezenter içinde dalak, ince bağırsak ve mideye bağlanan ve erişimi zorlaştıran dallı, dağınık dağılmış bir organdır. Doku ayrıca bitişik peristalsis ve solunumun neden olduğu harekete karşı oldukça hassastır. Pankreasın hareketini en aza indirmek, tek hücreli çözünürlük mikroskobu için çok önemlidir, çünkü birkaç mikronluk hareket artefaktları bile görüntüleri bulanıklaştırabilir ve bozabilir, bu da tek tek hücrelerin dinamiklerini izlemeyi imkansız hale getirir13.
IVI gerçekleştirmek için, bir abdominal görüntüleme penceresi (AIW) cerrahi olarak implante edilmelidir 9,11. AIW’yi cerrahi olarak implante etmek için, karın duvarına metal bir pencere çerçevesi dikilir. Daha sonra, ilgilenilen organ siyanoakrilat yapıştırıcı kullanılarak çerçeveye tutturulur. Bu, bazı sert iç organlar (örneğin, karaciğer, dalak, sert tümörler) için yeterli olsa da, sağlıklı murin pankreasını görüntüleme girişimleri, dokunun uyumlu dokusu ve karmaşık mimarisi nedeniyle optimal olmayan lateral ve eksenel stabilite nedeniyle tehlikeye girer14. Bu sınırlamayı ele almak için, Park ve ark.14, sağlıklı pankreas için özel olarak tasarlanmış bir görüntüleme penceresi geliştirdi. Bu Pankreas Görüntüleme Penceresi (PIW), pencere çerçevesi içinde, lamellerin hemen altına yatay bir metal raf ekleyerek, dokuyu stabilize ederek ve kapak camı ile temasını koruyarak bağırsak hareketinin ve solunumun etkisini en aza indirir. PIW daha fazla yanal stabilite sunarken, bu pencerenin hala eksenel kayma gösterdiğini ve ayrıca metal raf ile lamel15 arasındaki dar boşluk nedeniyle büyük katı tümörlerin görüntülenmesini önlediğini bulduk.
Bu sınırlamaları ele almak için, hem sağlıklı hem de hastalıklı pankreasın stabil uzun süreli görüntülemesini sağlayabilen implante edilebilir bir görüntüleme penceresi olan murin Pankreasın (SWIP) I ntravitalgörüntülemesi için Stabilize Window’u geliştirdik (Şekil 1)15. Burada, SWIP’yi implante etmek için kullanılan cerrahi prosedür için kapsamlı bir protokol sunuyoruz. Birincil amaç metastazda yer alan dinamik mekanizmaları incelemek olsa da, bu yöntem pankreas biyolojisi ve patolojisinin çeşitli yönlerini keşfetmek için de kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açıklanan SWIP protokolü, kanaviçe sepeti tekniğini kullanarak gelişmiş bir pankreas dokusu stabilizasyonu yöntemi sağlar. Erken abdominal görüntüleme pencereleri (AIW’ler), karın iç organlarının intravital görüntülemesini (IVI) mümkün kıldı, ancak pankreas gibi yumuşak dokuların hareketini yeterince sınırlamadı. Buna cevaben, Park ve ark. yatay bir metal raf içeren ve cam lamel ile teması sürdürürken pankreas dokusunun daha iyi stabilizasyonuna izin veren bir pankreas görüntüle…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Evelyn Lipper Yardım Vakfı, Gruss-Lipper Biyofotonik Merkezi, Kanser Araştırmaları için Entegre Görüntüleme Programı, NIH T-32 Bursu (CA200561) ve Savunma Bakanlığı Pankreas Kanseri Araştırma Programı (PCARP) hibe PA210223P1.
Materials
| 1% (w/v) solution of enzyme-active detergent | Alconox Inc | NA | Concentrated, anionic detergent with protease enzymes for manual and ultrasonic cleaning |
| 5% (w/v) solution of sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | Passivation reagent |
| 5 mm cover glass | Electron Microscopy Sciences | 72296-05 | Round Glass Coverslips |
| 7% (w/v) solution of citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | Passivation reagent |
| 28G 1 mL BD Insulin Syringe | BD | 329410 | Syringe for cell injection |
| Baytril 100 (enrofloxacin) | Bayer (Santa Cruz Biotechnology) | sc-362890Rx | Antibiotic |
| Bench Mount Heat Lamp | McMaster-Carr | 3349K51 | Heat lamp |
| Buprenorphine 0.3 mg/mL | Covetrus North America | 059122 | Buprenorphine Analgesia |
| Castroviejo Curved Scissors | World Precision Instruments | WP2220 | Scissor for cutting tissue |
| C57BL/6J Mouse | Jackson Laboratory | 000664 | C57BL/6J Mouse |
| Chlorhexidine solution | Durvet | 7-45801-10258-3 | Chlorhexidine Disinfectant Solution |
| Compressed air canister | Falcon | DPSJB-12 | Compressed air for drying tissue |
| Cyano acrylate – Gel Superglue | Staples | 234790-6 | Skin Glue |
| Cyano acrylate – Liquid Superglue | Staples | LOC1647358 | Coverslip Glue |
| DPBS 1x | Corning | 21-031-CV | DPBS for cerulein/cell injections |
| Gemini Cautery Kit | Harvard Apparatus | 726067 | Cautery Pen |
| Germinator 500 | CellPoint Scientific | GER 5287-120V | Bead Sterilizer |
| Graefe Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length | Roboz Surgical | RS-5135 | Graefe Micro Dissecting Forceps |
| Imaging microscope | NA | NA | See Entenberg et al. 2011 [27] |
| Imaging software | NA | NA | See Entenberg et al. 2011 [27] |
| Isoethesia (isoflurane) | Henry Schein Animal Health | 50033 | Isoflurane Anesthesia |
| Kim Wipes | Fisher Scientific | 06-666-A | Kim Wipes |
| Laboratory tape | Fisher Scientific | 159015R | Laboratory Tape |
| Mouse Dissecting Kit | World Precision Instruments | MOUSEKIT | Surgical Instruments |
| Mouse Paw Pulse Oximeter Sensor | Kent Scientific Corpo | MSTAT Sensor-MSE | Pulse Oximeter |
| Mouse Surgisuite | Kent Scientific | SURGI-M04 | Heated platform |
| Nair Hair Removal Lotion | Amazon | B001RVMR7K | Depilatory Lotion |
| Oxygen | TechAir | OX TM | Oxygen |
| PERMA-HAND Black Braided Silk Sutures, ETHICON Size 5-0 | VWR | 95056-872 | Silk Suture |
| Phosphate Buffered Saline 1x | Life Technologies | 10010-023 | PBS |
| PhysioSuite System | Kent Scientific | PhysioSuite | Heated Platform Controller |
| Puralube | Henry Schein Animal Health | 008897 | Eye Lubricant |
| Puritan Nonsterile Cotton-Tipped Swabs | Fisher Scientific | 867WCNOGLUE | Cotton Swabs |
| SHARP Precision Barrier Tips, For P-100, 100 µL | Denville Scientific Inc. | P1125 | 100 µL Pipet Tips |
| Tetramethylrhodamine isothiocyanate–Dextran | Sigma-Aldrich | T1287-500MG | Vascular Label |
| Window-fixturing plate | NA | NA | Custom made plate for window placement on microscope stage. Plate is made of 0.008 in stainless steel shim stock. For dimensions of plate see Entenberg et al., 2018 [8]. |
| Window Frame | NA | NA | The window is composed of a steel frame with a central aperture that accepts a 5 mm coverslip. A groove of 1.75 mm around the circumference of the frame provides space for the peritoneal muscle and skin layers to adhere to. See Entenberg et al., 2018 [8]. |
Referências
- Peery, A. F., et al. Burden and cost of gastrointestinal, liver, and pancreatic diseases in the United States: Update 2021. Gastroenterology. 162 (2), 621-644 (2022).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Wagle, N. S., Jemal, A. Cancer statistics, 2023. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 73 (1), 17-48 (2023).
- Adamska, A., Domenichini, A., Falasca, M. Pancreatic ductal adenocarcinoma: Current and evolving therapies. International Journal of Molecular Sciences. 18 (7), 1338 (2017).
- Coste, A., Oktay, M. H., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Intravital imaging techniques for biomedical and clinical research. Cytometry A. 97 (5), 448-457 (2020).
- Peters, N. C., et al. In vivo imaging reveals an essential role for neutrophils in leishmaniasis transmitted by sand flies. Science. 321 (5891), 970-974 (2008).
- Alexander, S., Koehl, G. E., Hirschberg, M., Geissler, E. K., Friedl, P. Dynamic imaging of cancer growth and invasion: a modified skin-fold chamber model. Histochemistry and Cell Biology. 130 (6), 1147-1154 (2008).
- Harney, A. S., et al. Real-time imaging reveals local, transient vascular permeability, and tumor cell intravasation stimulated by TIE2hi macrophage-derived VEGFA. Cancer Discovery. 5 (9), 932-943 (2015).
- Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
- Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Science Translational Medicine. 4 (158), 158ra145 (2012).
- Park, K., You, J., Du, C., Pan, Y. Cranial window implantation on mouse cortex to study microvascular change induced by cocaine. Quantitative Imaging in Medicine and Surgery. 5 (1), 97-107 (2015).
- Beerling, E., Oosterom, I., Voest, E., Lolkema, M., van Rheenen, J. Intravital characterization of tumor cell migration in pancreatic cancer. Intravital. 5 (3), e1261773 (2016).
- Entenberg, D., Oktay, M. H., Condeelis, J. S. Intravital imaging to study cancer progression and metastasis. Nature Reviews: Cancer. 23 (1), 25-42 (2023).
- Entenberg, D., et al. time-lapsed, large-volume, high-resolution intravital imaging for tissue-wide analysis of single cell dynamics. Methods. 128, 65-77 (2017).
- Park, I., Hong, S., Hwang, Y., Kim, P. A novel pancreatic imaging window for stabilized longitudinal in vivo observation of pancreatic islets in murine model. Diabetes & Metabolism Journal. 44 (1), 193-198 (2020).
- Du, W., et al. SWIP-a stabilized window for intravital imaging of the murine pancreas. Open Biology Journal. 12 (6), 210273 (2022).
- DeBold, T. A. M., James, W. . How To Passivate Stainless Steel Parts. , (2003).
- Drobizhev, M., Makarov, N. S., Tillo, S. E., Hughes, T. E., Rebane, A. Two-photon absorption properties of fluorescent proteins. Nature Methods. 8 (5), 393-399 (2011).
- Ueki, H., Wang, I. H., Zhao, D., Gunzer, M., Kawaoka, Y. Multicolor two-photon imaging of in vivo cellular pathophysiology upon influenza virus infection using the two-photon IMPRESS. Nature Protocols. 15 (3), 1041-1065 (2020).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), pdb prot5563 (2011).
- Moral, J. A., et al. ILC2s amplify PD-1 blockade by activating tissue-specific cancer immunity. Nature. 579 (7797), 130-135 (2020).
- Erstad, D. J., et al. Orthotopic and heterotopic murine models of pancreatic cancer and their different responses to FOLFIRINOX chemotherapy. Disease Models & Mechanisms. 11 (7), dmm034793 (2018).
- Harney, A. S., Wang, Y., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Extended time-lapse intravital imaging of real-time multicellular dynamics in the tumor microenvironment. Journal of Visualized Experiments. (112), e54042 (2016).
- Entenberg, D., et al. Imaging tumor cell movement in vivo. Current Protocols in Cell Biology. Chapter 19, 19.7.1-19.7.19 (2013).
- Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nature Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).
- Rodriguez-Tirado, C., et al. Long-term high-resolution intravital microscopy in the lung with a vacuum stabilized imaging window. Journal of Visualized Experiments. (116), 54603 (2016).
- Seynhaeve, A. L. B., Ten Hagen, T. L. M. Intravital microscopy of tumor-associated vasculature using advanced dorsal skinfold window chambers on transgenic fluorescent mice. Journal of Visualized Experiments. (131), 55115 (2018).
- Gorelick, F. S., Lerch, M. M. Do animal models of acute pancreatitis reproduce human disease. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 4 (2), 251-262 (2017).
- Dolai, S., et al. Depletion of the membrane-fusion regulator Munc18c attenuates caerulein hyperstimulation-induced pancreatitis. Journal of Biological Chemistry. 293 (7), 2510-2522 (2018).
- Niederau, C., Ferrell, L. D., Grendell, J. H. Caerulein-induced acute necrotizing pancreatitis in mice: protective effects of proglumide, benzotript, and secretin. Gastroenterology. 88 (5 Pt 1), 1192-1204 (1985).
- Dunphy, M. P., Entenberg, D., Toledo-Crow, R., Larson, S. M. In vivo microcartography and subcellular imaging of tumor angiogenesis: a novel platform for translational angiogenesis research. Microvascular Research. 78 (1), 51-56 (2009).
- Shanja-Grabarz, X., Coste, A., Entenberg, D., Di Cristofano, A. Real-time, high-resolution imaging of tumor cells in genetically engineered and orthotopic models of thyroid cancer. Endocrine-Related Cancer. 27 (10), 529-539 (2020).
