طرق تضمين تفاعلات تخليق البروتين الخالية من الخلايا في الهلاميات المائية على نطاق واسع
Summary
هنا ، نقدم بروتوكولين لتضمين تفاعلات تخليق البروتين الخالية من الخلايا في مصفوفات هيدروجيل على نطاق واسع دون الحاجة إلى مرحلة سائلة خارجية.
Abstract
توفر شبكات الجينات الاصطناعية منصة للعلماء والمهندسين لتصميم وبناء أنظمة جديدة ذات وظائف مشفرة على المستوى الجيني. في حين أن النموذج السائد لنشر شبكات الجينات هو داخل الهيكل الخلوي ، يمكن أيضا نشر شبكات الجينات الاصطناعية في بيئات خالية من الخلايا. تشمل التطبيقات الواعدة لشبكات الجينات الخالية من الخلايا أجهزة الاستشعار الحيوية ، حيث تم إثبات هذه الأجهزة ضد الأهداف الحيوية (فيروسات الإيبولا وزيكا و SARS-CoV-2) واللاأحيائية (المعادن الثقيلة والكبريتيدات والمبيدات الحشرية والملوثات العضوية الأخرى). عادة ما يتم نشر الأنظمة الخالية من الخلايا في شكل سائل داخل وعاء التفاعل. ومع ذلك ، فإن القدرة على تضمين مثل هذه التفاعلات في مصفوفة مادية قد تسهل تطبيقها على نطاق أوسع في مجموعة أوسع من البيئات. تحقيقا لهذه الغاية ، تم تطوير طرق لتضمين تفاعلات تخليق البروتين الخالي من الخلايا (CFPS) في مجموعة متنوعة من مصفوفات الهيدروجيل. واحدة من الخصائص الرئيسية للهلاميات المائية التي تفضي إلى هذا العمل هي قدرة إعادة تكوين المياه العالية لمواد الهيدروجيل. بالإضافة إلى ذلك ، تمتلك الهلاميات المائية خصائص فيزيائية وكيميائية مفيدة وظيفيا. يمكن تجفيف الهلاميات المائية بالتجميد للتخزين وإعادة ترطيبها لاستخدامها لاحقا. يتم تقديم بروتوكولين خطوة بخطوة لإدراج وفحص تفاعلات CFPS في الهلاميات المائية. أولا ، يمكن دمج نظام CFPS في هيدروجيل عن طريق الإماهة باستخدام محلول الخلية. يمكن بعد ذلك تحفيز النظام داخل الهيدروجيل أو التعبير عنه بشكل أساسي للتعبير الكامل عن البروتين من خلال الهيدروجيل. ثانيا ، يمكن إدخال محللة الخلية إلى هيدروجيل عند نقطة البلمرة ، ويمكن تجفيف النظام بأكمله بالتجميد وإعادة ترطيبه في وقت لاحق باستخدام محلول مائي يحتوي على محفز لنظام التعبير المشفر داخل الهيدروجيل. هذه الطرق لديها القدرة على السماح بشبكات الجينات الخالية من الخلايا التي تمنح القدرات الحسية لمواد الهيدروجيل ، مع إمكانية نشرها خارج المختبر.
Introduction
تدمج البيولوجيا التركيبية تخصصات هندسية متنوعة لتصميم وهندسة الأجزاء والأجهزة والأنظمة القائمة على أساس بيولوجي والتي يمكنها أداء وظائف غير موجودة في الطبيعة. لا تزال معظم مناهج البيولوجيا التركيبية مرتبطة بالخلايا الحية. على النقيض من ذلك ، تسهل أنظمة البيولوجيا التركيبية الخالية من الخلايا مستويات غير مسبوقة من التحكم والحرية في التصميم ، مما يتيح زيادة المرونة وتقصير الوقت لهندسة الأنظمة البيولوجية مع القضاء على العديد من قيود طرق التعبير الجيني التقليدية القائمة على الخلايا1،2،3. يتم استخدام CFPS في عدد متزايد من التطبيقات عبر العديد من التخصصات ، بما في ذلك بناء الخلايا الاصطناعية ، والنماذج الأولية للدوائر الجينية ، وتطوير أجهزة الاستشعار الحيوية ، وإنتاج المستقلبات4،5،6. كان CFPS مفيدا أيضا بشكل خاص لإنتاج البروتينات المؤتلفة التي لا يمكن التعبير عنها بسهولة في الخلايا الحية ، مثل البروتينات المعرضة للتجميع والبروتينات عبر الغشاء والبروتينات السامة6،7،8.
عادة ما يتم تنفيذ CFPS في التفاعلات السائلة. ومع ذلك ، قد يحد هذا من نشرها في بعض الحالات ، حيث يجب احتواء أي جهاز خال من الخلايا السائلة داخل وعاء تفاعل. كان الأساس المنطقي لتطوير الأساليب المعروضة هنا هو توفير بروتوكولات قوية لدمج أجهزة البيولوجيا التركيبية الخالية من الخلايا في الهلاميات المائية ، ليس كمنصة لإنتاج البروتين في حد ذاتها ، ولكن بدلا من ذلك ، للسماح باستخدام الهلاميات المائية كهيكل مادي لنشر الأجهزة الخالية من الخلايا خارج المختبر. استخدام الهلاميات المائية كهيكل CFPS له العديد من المزايا. الهلاميات المائية هي مواد بوليمرية ، على الرغم من ارتفاع نسبة الماء (التي تزيد أحيانا عن 98٪) ، إلا أنها تمتلك خصائص صلبة9،10،11. لها استخدامات كمعاجين ومواد تشحيم ومواد لاصقة وهي موجودة في منتجات متنوعة مثل العدسات اللاصقة وضمادات الجروح والأشرطة اللاصقة البحرية ومحسنات التربة وحفاضات الأطفال9،11،12،13،14. الهلاميات المائية هي أيضا قيد التحقيق النشط كمركبات توصيل المخدرات9،15،16،17. قد تكون الهلاميات المائية أيضا متوافقة حيويا وقابلة للتحلل البيولوجي وتمتلك بعض استجابات المحفزات الخاصة بها9،18،19،20. لذلك ، فإن الهدف هنا هو خلق تآزر بين الوظائف المشتقة من البيولوجيا الجزيئية وعلوم المواد. تحقيقا لهذه الغاية ، بذلت جهود لدمج البيولوجيا التركيبية الخالية من الخلايا مع مجموعة من المواد ، بما في ذلك الكولاجين ، اللابونيت ، بولي أكريلاميد ، الفيبرين ، ببتيد PEG ، والأغاروز 11،21،22 ، وكذلك لتغطية أسطح الزجاج والورق والقماش11،23،24 مع أجهزة CFPS. توضح البروتوكولات المعروضة هنا طريقتين لتضمين تفاعلات CFPS في مصفوفات هيدروجيل على نطاق واسع (أي >1 مم) ، باستخدام الأغاروز كمادة نموذجية. تم اختيار الأغاروز بسبب قدرته العالية على امتصاص الماء ، وخصائص التبلور الذاتي الخاضعة للرقابة ، والخصائص الميكانيكية القابلة للضبط11،24،25،26. يدعم Agarose أيضا CFPS الوظيفي ، وهو أرخص من العديد من بدائل الهيدروجيل الأخرى ، وهو قابل للتحلل البيولوجي ، مما يجعله خيارا جذابا كنظام نموذجي تجريبي. ومع ذلك ، فقد تم إثبات هذه الطرق سابقا على أنها مناسبة لتضمين CFPS في مجموعة من الهلاميات المائيةالبديلة 11. بالنظر إلى المجموعة الواسعة من تطبيقات الهلاميات المائية ووظائف CFPS ، يمكن أن توفر الطرق الموضحة هنا أساسا يمكن للباحثين من خلاله تطوير مواد هيدروجيل محسنة بيولوجيا تناسب غاياتهم الخاصة.
في الدراسات السابقة ، تم استخدام أنظمة microgel ذات نطاق حجم من 1 ميكرومتر إلى 400 ميكرومتر لأداء CFPS في الهلاميات المائية المغمورة في مخزن التفاعل23،27،28،29،30،31. غير أن اشتراط غمر الهلاميات المائية داخل مخازن تفاعل CFPS يحد من فرص نشرها كمواد في حد ذاتها. تسمح البروتوكولات المقدمة هنا بحدوث تفاعلات CFPS داخل الهلاميات المائية دون الحاجة إلى غمر المواد الهلامية في مخازن التفاعل. ثانيا ، يسمح استخدام المواد الهلامية الكبيرة (بين 2 مم و 10 مم في الحجم) بدراسة التفاعل الفيزيائي بين الهلاميات المائية والتعبير الجيني الخالي من الخلايا. على سبيل المثال ، باستخدام هذه التقنية ، من الممكن دراسة كيفية تأثير مصفوفة الهيدروجيل على تفاعلات CFPS11 وكيف يمكن أن تؤثر تفاعلات CFPS على مصفوفة الهيدروجيل31. تسمح الأحجام الأكبر من الهلاميات المائية أيضا بتطوير مواد جديدة قابلة للبرمجة الحيوية32. أخيرا ، من خلال تضمين تفاعلات CFPS في الهلاميات المائية ، هناك أيضا انخفاض محتمل في متطلبات أوعية التفاعل البلاستيكية. لنشر أجهزة الاستشعار الخالية من الخلايا ، فإن هذا له مزايا واضحة على الأجهزة التي تعتمد على الأدوات البلاستيكية. مجتمعة ، يوفر تضمين تفاعلات CFPS في الهلاميات المائية العديد من المزايا لنشر الأجهزة الخالية من الخلايا خارج المختبر.
الهدف العام من الطرق المعروضة هنا هو السماح بتشغيل تفاعلات CFPS داخل مصفوفات الهيدروجيل. تم عرض طريقتين مختلفتين لتضمين تفاعلات إنتاج البروتين الخالية من الخلايا في مواد هيدروجيل واسعة النطاق (الشكل 1). في الطريقة أ ، يتم إدخال مكونات CFPS إلى الهلاميات المائية الأغاروز المجففة بالتجميد لتشكيل نظام نشط. في الطريقة ب ، يتم خلط الأغاروز المنصهر مع مكونات تفاعل CFPS لتشكيل نظام هيدروجيل CFPS كامل ، والذي يتم تجفيفه بالتجميد وتخزينه لحين الحاجة. يمكن إعادة إماهة هذه الأنظمة بحجم من الماء أو المخزن المؤقت وتحليلها لبدء التفاعل.
تستخدم هذه الدراسة الأنظمة القائمة على تحلل الخلايا الإشريكية القولونية. هذه بعض أنظمة CFPS التجريبية الأكثر شيوعا ، حيث أن تحضير محلول خلايا الإشريكية القولونية بسيط وغير مكلف ويحقق غلات عالية من البروتين. تستكمل محللة الخلية بالمكونات الجزيئية الكبيرة اللازمة لإجراء النسخ والترجمة ، بما في ذلك الريبوسومات ، والحمض النووي الريبوزي الناقل (tRNAs) ، وتخليق أمينواسيل-الحمض النووي الريبي ، وعوامل البدء والاستطالة والإنهاء. على وجه التحديد ، توضح هذه الورقة إنتاج eGFP و mCherry في الهلاميات المائية للأغاروز باستخدام خلايا الإشريكية القولونية المحللة وتراقب ظهور التألق باستخدام قارئ الألواح والمجهر متحد البؤر. يمكن رؤية النتائج التمثيلية لقارئ لوحة المعايرة الدقيقة في Whitfield et al.31 ، والبيانات الأساسية متاحة للجمهور 33. علاوة على ذلك ، يتم تأكيد التعبير عن البروتينات الفلورية في جميع أنحاء المواد الهلامية باستخدام المجهر متحد البؤر. يسمح البروتوكولان الموضح في هذه الورقة بتجميع وتخزين الأجهزة الجينية القائمة على CFPS في المواد بهدف نهائي يتمثل في خلق بيئة مادية مناسبة لتوزيع دوائر الجينات الخالية من الخلايا بطريقة تدعم النشر الميداني.
Protocol
Representative Results
Discussion
فيما يلي بروتوكولان لدمج تفاعلات CFPS القائمة على تحلل خلايا الإشريكية القولونية في الهلاميات المائية للأغاروز. تسمح هذه الطرق بالتعبير الجيني المتزامن في جميع أنحاء المادة. يمكن تكييف البروتوكول مع أنظمة CFPS الأخرى وقد تم إجراؤه بنجاح باستخدام مجموعات CFPS المتاحة تجاريا بالإضافة إلى ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يقر المؤلفون تقديرا كبيرا بدعم جوائز مجلس أبحاث التكنولوجيا الحيوية والعلوم البيولوجية BB / V017551 / 1 (S.K. ، T.P.H.) و BB / W01095X / 1 (A.L. ، T.P.H.) ، ومجلس أبحاث العلوم الهندسية والفيزيائية – جائزة مختبرات علوم وتكنولوجيا الدفاع EP / N026683 / 1 (C.J.W. ، A.M.B. ، T.P.H.). البيانات التي تدعم هذا المنشور متاحة علنا على: 10.25405/data.ncl.22232452. لغرض الوصول المفتوح ، قام المؤلف بتطبيق ترخيص المشاع الإبداعي (CC BY) على أي نسخة مخطوطة مقبولة من المؤلف ناشئة.
Materials
| Material | |||
| 3-PGA | Santa Cruz Biotechnology | sc-214793B | |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Agar | Thermo Fisher Scientific | A10752.22 | |
| Agarose | Severn Biotech | 30-15-50 | |
| Amino Acid Sampler Kit | VWR | BTRABR1401801 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A8937-1G | |
| cAMP | Sigma-Aldrich | A9501-1G | |
| Coenzyme A (CoA) | Sigma-Aldrich | C4282-100MG | |
| CTP | Alfa Aesar | J14121.MC | |
| DTT | Thermo Fisher Scientific | R0862 | |
| Folinic Acid | Sigma-Aldrich | F7878-100MG | |
| GTP | Carbosynth | NG01208 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-25G | |
| K-glutamate | Sigma-Aldrich | G1149-100G | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876-1G | |
| Mg-glutamate | Sigma-Aldrich | 49605-250G | |
| NAD | Sigma-Aldrich | N6522-250MG | |
| PEG-8000 | Promega | V3011 | |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 757551-5G | |
| Potassium Phosphate Dibasic (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | P3786-500G | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | RDD037-500G | |
| Protease Inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P2714-1BTL | |
| Qubit Protein concentration kit | Thermo Fisher Scientific | A50668 | |
| Rossetta 2 DE 3 E.coli | Sigma-Aldrich | 71397-3 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888-500G | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | 85558-1G | |
| Tryptone | Thermo Fisher Scientific | 211705 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | GE17-1321-01 | |
| tRNA | Sigma-Aldrich | 10109541001 | |
| UTP | Alfa Aesar | J23160.MC | |
| Yeast Extract | Sigma-Aldrich | Y1625-1KG | |
| Equipment | |||
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | HS4323-500EA | |
| 10K MWCO dialysis cassettes | Thermo Fisher Scientific | 66381 | |
| 15 mL centrifuge tube | Sarstedt | 62.554.502 | |
| 50 mL centrifuge bottles | Sarstedt | 62.547.254 | |
| 500 mL centrifuge bottles | Thermo Fisher Scientific | 3120-9500 | |
| Alpha 1-2 LD Plus freeze-dryer | Christ | part no. 101521, 101522, 101527 | |
| Benchtop Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | H-X3R | |
| Black 384 well microtitre plates | Fischer Scientific | 66 | |
| Cuvettes | Thermo Fisher Scientific | 222S | |
| Elga Purelab Chorus | Elga | ##### | |
| Eppendorf Microcentrifuge 5425R | Eppendorf | EP00532 | |
| High Speed Centrifuge | Beckman Coulter | B34183 | |
| JMP license | SAS Institute | 15 | |
| Magnetic Stirrer | Fischer Scientific | 15353518 | |
| Parafilm | Amcor | PM-966 | |
| Photospectrometer (Biophotometer) | Eppendorf | 16713 | |
| Pipettes and tips | Gilson | ##### | |
| Precision Balance | Sartorius | 16384738 | |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q32866 | |
| Shaking Incubator | Thermo Fisher Scientific | SHKE8000 | |
| Sonic Dismembrator (Sonicator) | Thermo Fisher Scientific | 12893543 | |
| Static Incubator | Sanyo | MIR-162 | |
| Syringe and needles | Thermo Fisher Scientific | 66490 | |
| Thermo max Q8000 (Shaking Incubator) | Thermo Fisher Scientific | SHKE8000 | |
| Varioskan Lux platereader | Thermo Fisher Scientific | VLBL00GD1 | |
| Vortex Genie 2 | Cole-parmer | OU-04724-05 | |
| VWR PHenomenal pH 1100 L, ph/mv/°c meter | VWR | 662-1657 |
Referências
- Lu, Y. Cell-free synthetic biology: Engineering in an open world. Synthetic and System Biotechnology. 2 (1), 23-27 (2017).
- Perez, J. G., Stark, J. C., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: Engineering beyond the cell. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (12), e023853 (2016).
- Jiang, L., Zhao, J., Lian, J., Xu, Z. Cell-free protein synthesis enabled rapid prototyping for metabolic engineering and synthetic biology. Synthetic and System Biotechnology. 3 (2), 90-96 (2018).
- Kopniczky, M. B., et al. Cell-free protein synthesis as a prototyping platform for mammalian synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 9 (1), 144-156 (2020).
- Pandi, A., Grigoras, I., Borkowski, O., Faulon, J. L. Optimizing cell-free biosensors to monitor enzymatic production. ACS Synthetic Biology. 8 (8), 1952-1957 (2019).
- Khambhati, K., Bhattacharjee, G., Gohil, N., Braddick, D., Kulkarni, V. S. V. Exploring the potential of cell-free protein synthesis for extending the abilities of biological systems. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 248 (2019).
- Focke, P. J., et al. Combining in vitro folding with cell free protein synthesis for membrane protein expression. Bioquímica. 55 (30), 4212-4219 (2016).
- Fogeron, M. L., Lecoq, L., Cole, L., Harbers, M., Böckmann, A. Easy synthesis of complex biomolecular assemblies: wheat germ cell-free protein expression in structural biology. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 63958 (2021).
- Bashir, S., et al. Fundamental concepts of hydrogels: synthesis, properties, and their applications. Polymers. 12 (11), 2702 (2020).
- Loo, S. L., Vásquez, L., Athanassiou, A., Fragouli, D. Polymeric hydrogels-A promising platform in enhancing water security for a sustainable future. Advanced Material Interfaces. 8 (24), 2100580 (2021).
- Whitfield, C. J., et al. Cell-free protein synthesis in hydrogel materials. Chemical Communications. 56 (52), 7108-7111 (2020).
- Yao, H., et al. Design strategies for adhesive hydrogels with natural antibacterial agents as wound dressings: Status and trends. Materials Today Bio. 15, 100429 (2022).
- Musgrave, C. S. A., Fang, F. Contact lens materials: A materials science perspective. Materials. 12 (2), 261 (2019).
- Maher, A. J., Rana, A. G., Rawan, A. Recovery of hydrogel from baby diaper wastes and its application for enhancing soil irrigation management. Journal of Environmental Management. 239, 255-261 (2019).
- Vigata, M., Meinert, C., Hutmacher, D. W., Bock, N. Hydrogels as drug delivery systems: A review of current characterization and evaluation techniques. Pharmaceutics. 12 (12), 1188 (2020).
- Jacob, S., et al. Emerging role of hydrogels in drug delivery systems, tissue engineering and wound management. Pharmaceutics. 3 (3), 357 (2021).
- Senapati, S., et al. Controlled drug delivery vehicles for cancer treatment and their performance. Signal Transduction and Targeted Therapy. 3, 7 (2018).
- Chen, Y., et al. A biocompatible, stimuli-responsive, and injectable hydrogel with triple dynamic bonds. Molecules. 25 (13), 3050 (2020).
- Shi, Q., et al. Bioactuators based on stimulus-responsive hydrogels and their emerging biomedical applications. NPG Asia Materials. 11, 64 (2019).
- Fan, M., Tan, H. Biocompatible conjugation for biodegradable hydrogels as drug and cell scaffolds. Cogent Engineering. 7 (1), 1736407 (2020).
- Byun, J. Y., Lee, K. H., Lee, K. Y., Kim, M. G., Kim, D. M. In-gel expression and in situ immobilization of proteins for generation of three-dimensional protein arrays in a hydrogel matrix. Lab on a Chip. 13 (5), 886-891 (2013).
- Zhou, X., Wu, H., Cui, M., Lai, S. N., Zheng, B. Long-lived protein expression in hydrogel particles: Towards artificial cells. Chemical Science. 9 (18), 4275-4279 (2018).
- Huang, A., et al. BiobitsTM explorer: A modular synthetic biology education kit. Science Advances. 4 (8), 5105 (2018).
- Jaramillo-Isaza, S., Alfonso-Rodriguez, C. A., Rios-Rojas, J. F., García-Guzmán, J. A. Dynamic mechanical analysis of agarose-based biopolymers with potential use in regenerative medicine. Materials Today Proceeding. 49, 16-22 (2022).
- Wang, B. X., Xu, W., Yang, Z., Wu, Y. An overview on recent progress of the hydrogels: from material resources, properties to functional applications. Macromolecular Rapid Communications. 43 (6), 2100785 (2022).
- Salati, M. A., et al. Agarose-based biomaterials: Opportunities and challenges in cartilage tissue engineering. Polymers. 12 (5), 1150 (2020).
- Buddingh, B. C., Van Hest, J. C. M. Artificial cells: Synthetic compartments with life-like functionality and adaptivity. Accounts of Chemical Research. 50 (4), 769-777 (2017).
- Kahn, J. S., et al. DNA microgels as a platform for cell-free protein expression and display. Biomacromolecules. 17 (6), 2019-2026 (2016).
- Yang, D., et al. Enhanced transcription and translation in clay hydrogel and implications for early life evolution. Scientific Reports. 3, 3165 (2013).
- Zhou, X., Wu, H., Cui, M., Lai, S. N., Zheng, B. Long-lived protein expression in hydrogel particles: Towards artificial cells. Chemical Science. 9 (18), 4275-4279 (2018).
- Whitfield, C. J., et al. Cell-free genetic devices confer autonomic and adaptive properties to hydrogels. BioRxiv. , (2019).
- Feng, L., Jianpu, T., Jinhui, G. D., Luo, D. Y. Polymeric DNA hydrogel: Design, synthesis and applications. Progress in Polymer Science. 98, 101163 (2019).
- Howard, T., et al. Datasets for Whitfield et al. 2020 Chemical Communications. , (2020).
- Banks, A. M., et al. Key reaction components affect the kinetics and performance robustness of cell-free protein synthesis reactions. Computational and Structural Biotechnology Journal. 20, 218-229 (2022).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli-based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments. (79), e50762 (2013).
- Moore, S. J., et al. EcoFlex: A multifunctional MoClo kit for E. coli synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 5 (10), 1059-1069 (2016).
- Benítez-Mateos, A. I., et al. Micro compartmentalized cell-free protein synthesis in hydrogel µ-channels. ACS Synthetic Biology. 9 (11), 2971-2978 (2020).
