मैक्रो-स्केल हाइड्रोगेल में सेल-फ्री प्रोटीन संश्लेषण प्रतिक्रियाओं को एम्बेड करने के तरीके
Summary
यहां, हम बाहरी तरल चरण की आवश्यकता के बिना मैक्रो-स्केल हाइड्रोगेल मैट्रिसेस में सेल-मुक्त प्रोटीन संश्लेषण प्रतिक्रियाओं को एम्बेड करने के लिए दो प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।
Abstract
सिंथेटिक जीन नेटवर्क वैज्ञानिकों और इंजीनियरों को आनुवंशिक स्तर पर एन्कोड की गई कार्यक्षमता के साथ नई प्रणालियों को डिजाइन और निर्माण करने के लिए एक मंच प्रदान करते हैं। जबकि जीन नेटवर्क की तैनाती के लिए प्रमुख प्रतिमान एक सेलुलर चेसिस के भीतर है, सिंथेटिक जीन नेटवर्क को सेल-मुक्त वातावरण में भी तैनात किया जा सकता है। सेल-मुक्त जीन नेटवर्क के आशाजनक अनुप्रयोगों में बायोसेंसर शामिल हैं, क्योंकि इन उपकरणों को जैविक (इबोला, जीका और सार्स-सीओवी-2 वायरस) और अजैविक (भारी धातु, सल्फाइड, कीटनाशक, और अन्य कार्बनिक संदूषक) लक्ष्यों के खिलाफ प्रदर्शित किया गया है। सेल-फ्री सिस्टम आमतौर पर एक प्रतिक्रिया पोत के भीतर तरल रूप में तैनात होते हैं। एक भौतिक मैट्रिक्स में ऐसी प्रतिक्रियाओं को एम्बेड करने में सक्षम होने के नाते, हालांकि, वातावरण के व्यापक सेट में उनके व्यापक अनुप्रयोग की सुविधा हो सकती है। इसके लिए, विभिन्न प्रकार के हाइड्रोगेल मैट्रिसेस में सेल-मुक्त प्रोटीन संश्लेषण (सीएफपीएस) प्रतिक्रियाओं को एम्बेड करने के तरीके विकसित किए गए हैं। इस काम के लिए अनुकूल हाइड्रोगेल के प्रमुख गुणों में से एक हाइड्रोगेल सामग्री की उच्च-जल पुनर्गठन क्षमता है। इसके अतिरिक्त, हाइड्रोगेल में भौतिक और रासायनिक विशेषताएं होती हैं जो कार्यात्मक रूप से फायदेमंद होती हैं। हाइड्रोगेल को भंडारण के लिए फ्रीज-सुखाया जा सकता है और बाद में उपयोग के लिए पुनर्जलीकृत किया जा सकता है। हाइड्रोगेल में सीएफपीएस प्रतिक्रियाओं के समावेश और परख के लिए दो चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल प्रस्तुत किए गए हैं। सबसे पहले, एक सीएफपीएस प्रणाली को सेल लाइसेट के साथ पुनर्जलीकरण के माध्यम से हाइड्रोगेल में शामिल किया जा सकता है। हाइड्रोगेल के भीतर की प्रणाली को हाइड्रोगेल के माध्यम से पूर्ण प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए प्रेरित या संवैधानिक रूप से व्यक्त किया जा सकता है। दूसरा, सेल लाइसेट को पोलीमराइजेशन के बिंदु पर एक हाइड्रोगेल में पेश किया जा सकता है, और पूरे सिस्टम को बाद में हाइड्रोगेल के भीतर एन्कोड किए गए अभिव्यक्ति प्रणाली के लिए इंड्यूसर युक्त जलीय घोल के साथ फ्रीज-सुखाया और पुनर्जलीकृत किया जा सकता है। इन विधियों में सेल-मुक्त जीन नेटवर्क की अनुमति देने की क्षमता है जो प्रयोगशाला से परे तैनाती की क्षमता के साथ हाइड्रोगेल सामग्री को संवेदी क्षमताएं प्रदान करते हैं।
Introduction
सिंथेटिक जीव विज्ञान जैविक रूप से आधारित भागों, उपकरणों और प्रणालियों को डिजाइन और इंजीनियर करने के लिए विविध इंजीनियरिंग विषयों को एकीकृत करता है जो उन कार्यों को कर सकते हैं जो प्रकृति में नहीं पाए जाते हैं। अधिकांश सिंथेटिक जीव विज्ञान दृष्टिकोण अभी भी जीवित कोशिकाओं से बंधे हैं। इसके विपरीत, सेल-मुक्त सिंथेटिक जीव विज्ञान प्रणाली डिजाइन में नियंत्रण और स्वतंत्रता के अभूतपूर्व स्तर की सुविधा प्रदान करती है, जिससे पारंपरिक सेल-आधारित जीनअभिव्यक्ति विधियों 1,2,3 की कई बाधाओं को समाप्त करते हुए इंजीनियरिंग जैविक प्रणालियों के लिए लचीलापन और कम समय में वृद्धि होती है। सीएफपीएस का उपयोग कृत्रिम कोशिकाओं के निर्माण, प्रोटोटाइप आनुवंशिक सर्किट, बायोसेंसर विकसित करने और मेटाबोलाइट्स 4,5,6 का उत्पादन करने सहित कई विषयों में अनुप्रयोगों की बढ़ती संख्या में किया जा रहा है। सीएफपीएस पुनः संयोजक प्रोटीन के उत्पादन के लिए भी विशेष रूप से उपयोगी रहा है जिसे जीवित कोशिकाओं में आसानी से व्यक्त नहीं किया जा सकता है, जैसे एकत्रीकरण-प्रवण प्रोटीन, ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन और विषाक्त प्रोटीन 6,7,8।
सीएफपीएस आमतौर पर तरल प्रतिक्रियाओं में किया जाता है। यह, हालांकि, कुछ स्थितियों में उनकी तैनाती को प्रतिबंधित कर सकता है, क्योंकि किसी भी तरल सेल-मुक्त उपकरण को प्रतिक्रिया पोत के भीतर निहित किया जाना चाहिए। यहां प्रस्तुत विधियों के विकास के लिए तर्क हाइड्रोगेल में सेल-मुक्त सिंथेटिक जीव विज्ञान उपकरणों को एम्बेड करने के लिए मजबूत प्रोटोकॉल प्रदान करना था, न कि प्रोटीन उत्पादन मंच के रूप में, बल्कि इसके बजाय, प्रयोगशाला से परे सेल-मुक्त उपकरणों की तैनाती के लिए भौतिक चेसिस के रूप में हाइड्रोगेल के उपयोग की अनुमति देना। सीएफपीएस चेसिस के रूप में हाइड्रोगेल के उपयोग के कई फायदे हैं। हाइड्रोगेल बहुलक सामग्री हैं, जो उच्च पानी की मात्रा (कभी-कभी 98% से अधिक) के बावजूद, ठोस गुण 9,10,11 होते हैं। उनके पास पेस्ट, स्नेहक और चिपकने वाले के रूप में उपयोग किया जाता है और संपर्क लेंस, घाव ड्रेसिंग, समुद्री चिपकने वाला टेप, मिट्टी में सुधार करने वाले और बेबी डायपर 9,11,12,13,14 जैसे विविध उत्पादों में मौजूद होते हैं। हाइड्रोजेल भी सक्रिय जांच के अधीन हैं क्योंकि दवा वितरण वाहन 9,15,16,17 हैं। हाइड्रोगेल जैव-संगत, बायोडिग्रेडेबल भी हो सकते हैं, और उनके पास अपने स्वयं के 9,18,19,20 की कुछ उत्तेजना प्रतिक्रियाएं होती हैं। इसलिए, यहां लक्ष्य आणविक जीव विज्ञान-व्युत्पन्न कार्यक्षमता और सामग्री विज्ञान के बीच तालमेल बनाना है। इसके लिए, कोलेजन, लैपोनाइट, पॉलीक्रिलामाइड, फाइब्रिन, पीईजी-पेप्टाइड और एगारोस 11,21,22 सहित कई सामग्रियों के साथ सेल-मुक्त सिंथेटिक जीव विज्ञान को एकीकृत करने के प्रयास किए गए हैं, साथ ही साथ कांच, कागज और कपड़े 11,23,24 की सतहों को कोट करने के लिए भी। सीएफपीएस उपकरणों के साथ। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल मैक्रो-स्केल (यानी, >1 मिमी) हाइड्रोगेल मैट्रिसेस में सीएफपीएस प्रतिक्रियाओं को एम्बेड करने के लिए दो तरीकों का प्रदर्शन करते हैं, उदाहरण सामग्री के रूप में अगारोस का उपयोग करते हैं। Agarose को इसकी उच्च जल अवशोषण क्षमता, नियंत्रित स्व-गेलिंग गुणों और ट्यूनेबल यांत्रिक गुणों 11,24,25,26 के कारण चुना गया था। Agarose कार्यात्मक CFPS का भी समर्थन करता है, कई अन्य हाइड्रोगेल विकल्पों की तुलना में सस्ता है, और बायोडिग्रेडेबल है, जिससे यह एक प्रयोगात्मक मॉडल प्रणाली के रूप में एक आकर्षक विकल्प बन जाता है। हालांकि, इन विधियों को पहले वैकल्पिक हाइड्रोगेल11 की एक श्रृंखला में सीएफपीएस एम्बेड करने के लिए उपयुक्त के रूप में प्रदर्शित किया गया है। हाइड्रोगेल के अनुप्रयोगों की विस्तृत श्रृंखला और सीएफपीएस की कार्यक्षमता को ध्यान में रखते हुए, यहां प्रदर्शित विधियां एक आधार प्रदान कर सकती हैं जिससे शोधकर्ता अपने स्वयं के सिरों के अनुकूल जैविक रूप से बढ़ी हुई हाइड्रोगेल सामग्री विकसित करने में सक्षम हैं।
पिछले अध्ययनों में, प्रतिक्रिया बफर 23,27,28,29,30,31 में डूबे हाइड्रोगेल में सीएफपीएस करने के लिए 1 μm से 400 μm की आकार सीमा वाले माइक्रोगेल सिस्टम का उपयोग किया गया है। सीएफपीएस प्रतिक्रिया बफर के भीतर हाइड्रोगेल को जलमग्न करने की आवश्यकता, हालांकि, अपने आप में सामग्री के रूप में उनकी तैनाती के अवसरों को सीमित करती है। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल सीएफपीएस प्रतिक्रियाओं को प्रतिक्रिया बफर में जैल को डुबोने की आवश्यकता के बिना हाइड्रोगेल के भीतर होने की अनुमति देते हैं। दूसरा, मैक्रोस्केल जैल (आकार में 2 मिमी और 10 मिमी के बीच) का उपयोग हाइड्रोगेल और सेल-मुक्त जीन अभिव्यक्ति के बीच भौतिक बातचीत के अध्ययन की अनुमति देता है। उदाहरण के लिए, इस तकनीक के साथ, यह अध्ययन करना संभव है कि हाइड्रोगेल मैट्रिक्स सीएफपीएस प्रतिक्रियाओं को कैसे प्रभावित करता है11 और सीएफपीएस प्रतिक्रियाएं हाइड्रोगेल मैट्रिक्स31 को कैसे प्रभावित कर सकती हैं। हाइड्रोगेल के बड़े आकार भी नवीन, जैव-प्रोग्रामयोग्य सामग्री के विकास की अनुमति देते हैं। अंत में, हाइड्रोगेल में सीएफपीएस प्रतिक्रियाओं को एम्बेड करके, प्लास्टिक प्रतिक्रिया वाहिकाओं की आवश्यकता में भी संभावित कमी है। सेल-मुक्त सेंसर की तैनाती के लिए, प्लास्टिक वेयर पर निर्भर उपकरणों पर इसके स्पष्ट फायदे हैं। एक साथ लिया गया, हाइड्रोगेल में सीएफपीएस प्रतिक्रियाओं को एम्बेड करना प्रयोगशाला से परे सेल-मुक्त उपकरणों की तैनाती के लिए कई फायदे प्रदान करता है।
यहां प्रस्तुत विधियों का समग्र लक्ष्य हाइड्रोगेल मैट्रिसेस के भीतर सीएफपीएस प्रतिक्रियाओं के संचालन की अनुमति देना है। मैक्रो-स्केल हाइड्रोगेल सामग्री (चित्रा 1) में सेल-मुक्त प्रोटीन उत्पादन प्रतिक्रियाओं को एम्बेड करने के लिए दो अलग-अलग तरीकों का प्रदर्शन किया जाता है। विधि ए में, सीएफपीएस घटकों को एक सक्रिय प्रणाली बनाने के लिए लियोफिलाइज्ड एगारोस हाइड्रोगेल में पेश किया जाता है। विधि बी में, पिघले हुए अगारोस को सीएफपीएस प्रतिक्रिया घटकों के साथ मिलाकर एक पूर्ण सीएफपीएस हाइड्रोगेल सिस्टम बनाया जाता है, जिसे तब लियोफिलाइज किया जाता है और आवश्यकता होने तक संग्रहीत किया जाता है। प्रतिक्रिया शुरू करने के लिए इन प्रणालियों को पानी या बफर और विश्लेषण की मात्रा के साथ पुनर्जलीकृत किया जा सकता है।
यह अध्ययन एस्चेरिचिया कोलाई सेल लाइसेट-आधारित प्रणालियों का उपयोग करता है। ये सबसे लोकप्रिय प्रयोगात्मक सीएफपीएस प्रणालियों में से कुछ हैं, क्योंकि ई कोलाई सेल लाइसेट तैयारी सरल, सस्ती है, और उच्च प्रोटीन पैदावार प्राप्त करती है। सेल लाइसेट को प्रतिलेखन और अनुवाद करने के लिए आवश्यक मैक्रोमोलेक्यूलर घटकों के साथ पूरक किया जाता है, जिसमें राइबोसोम, टीआरएनए, एमिनोसिल-टीआरएनए सिंथेटेस और दीक्षा, बढ़ाव और समाप्ति कारक शामिल हैं। विशेष रूप से, यह पेपर ई कोलाई सेल लाइसेट का उपयोग करके एगारोस हाइड्रोगेल में ईजीएफपी और एमचेरी के उत्पादन को प्रदर्शित करता है और प्लेट रीडर और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके प्रतिदीप्ति की उपस्थिति की निगरानी करता है। माइक्रोटिटर प्लेट रीडर के प्रतिनिधि परिणाम व्हिटफील्ड एट अल .31 में देखे जा सकते हैं, और अंतर्निहित डेटा सार्वजनिक रूपसे उपलब्ध हैं। इसके अलावा, पूरे जैल में फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति की पुष्टि कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके की जाती है। इस पेपर में प्रदर्शित दो प्रोटोकॉल क्षेत्र तैनाती के सहायक तरीके से सेल-मुक्त जीन सर्किटरी के वितरण के लिए एक उपयुक्त भौतिक वातावरण बनाने के अंतिम लक्ष्य के साथ मटेरिया में सीएफपीएस-आधारित आनुवंशिक उपकरणों के संयोजन और भंडारण की अनुमति देते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
कोलाई सेल लाइसेट-आधारित सीएफपीएस प्रतिक्रियाओं को एगारोस हाइड्रोगेल में शामिल करने के लिए यहां दो प्रोटोकॉल दिए गए हैं। ये विधियां पूरे सामग्री में एक साथ जीन अभिव्यक्ति की अनुमति देती हैं। प्रो?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक जैव प्रौद्योगिकी और जैविक विज्ञान अनुसंधान परिषद पुरस्कार बीबी/V017551/1 (एस.के., टी.पी.एच.) और बीबी/W01095X/1 (ए.एल., टी.पी.एच.) और इंजीनियरिंग और भौतिक विज्ञान अनुसंधान परिषद – रक्षा विज्ञान और प्रौद्योगिकी प्रयोगशालाएं पुरस्कार ईपी/N026683/1 (सी.जे.डब्ल्यू., ए.एम.बी., टी.पी.एच.) के समर्थन को स्वीकार करते हैं। इस प्रकाशन का समर्थन करने वाले डेटा खुले तौर पर उपलब्ध हैं: 10.25405/ data.ncl.22232452. खुली पहुंच के उद्देश्य से, लेखक ने उत्पन्न होने वाले किसी भी लेखक स्वीकृत पांडुलिपि संस्करण के लिए क्रिएटिव कॉमन्स एट्रिब्यूशन (सीसी बीवाई) लाइसेंस लागू किया है।
Materials
| Material | |||
| 3-PGA | Santa Cruz Biotechnology | sc-214793B | |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Agar | Thermo Fisher Scientific | A10752.22 | |
| Agarose | Severn Biotech | 30-15-50 | |
| Amino Acid Sampler Kit | VWR | BTRABR1401801 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A8937-1G | |
| cAMP | Sigma-Aldrich | A9501-1G | |
| Coenzyme A (CoA) | Sigma-Aldrich | C4282-100MG | |
| CTP | Alfa Aesar | J14121.MC | |
| DTT | Thermo Fisher Scientific | R0862 | |
| Folinic Acid | Sigma-Aldrich | F7878-100MG | |
| GTP | Carbosynth | NG01208 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-25G | |
| K-glutamate | Sigma-Aldrich | G1149-100G | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876-1G | |
| Mg-glutamate | Sigma-Aldrich | 49605-250G | |
| NAD | Sigma-Aldrich | N6522-250MG | |
| PEG-8000 | Promega | V3011 | |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 757551-5G | |
| Potassium Phosphate Dibasic (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | P3786-500G | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | RDD037-500G | |
| Protease Inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P2714-1BTL | |
| Qubit Protein concentration kit | Thermo Fisher Scientific | A50668 | |
| Rossetta 2 DE 3 E.coli | Sigma-Aldrich | 71397-3 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888-500G | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | 85558-1G | |
| Tryptone | Thermo Fisher Scientific | 211705 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | GE17-1321-01 | |
| tRNA | Sigma-Aldrich | 10109541001 | |
| UTP | Alfa Aesar | J23160.MC | |
| Yeast Extract | Sigma-Aldrich | Y1625-1KG | |
| Equipment | |||
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | HS4323-500EA | |
| 10K MWCO dialysis cassettes | Thermo Fisher Scientific | 66381 | |
| 15 mL centrifuge tube | Sarstedt | 62.554.502 | |
| 50 mL centrifuge bottles | Sarstedt | 62.547.254 | |
| 500 mL centrifuge bottles | Thermo Fisher Scientific | 3120-9500 | |
| Alpha 1-2 LD Plus freeze-dryer | Christ | part no. 101521, 101522, 101527 | |
| Benchtop Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | H-X3R | |
| Black 384 well microtitre plates | Fischer Scientific | 66 | |
| Cuvettes | Thermo Fisher Scientific | 222S | |
| Elga Purelab Chorus | Elga | ##### | |
| Eppendorf Microcentrifuge 5425R | Eppendorf | EP00532 | |
| High Speed Centrifuge | Beckman Coulter | B34183 | |
| JMP license | SAS Institute | 15 | |
| Magnetic Stirrer | Fischer Scientific | 15353518 | |
| Parafilm | Amcor | PM-966 | |
| Photospectrometer (Biophotometer) | Eppendorf | 16713 | |
| Pipettes and tips | Gilson | ##### | |
| Precision Balance | Sartorius | 16384738 | |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q32866 | |
| Shaking Incubator | Thermo Fisher Scientific | SHKE8000 | |
| Sonic Dismembrator (Sonicator) | Thermo Fisher Scientific | 12893543 | |
| Static Incubator | Sanyo | MIR-162 | |
| Syringe and needles | Thermo Fisher Scientific | 66490 | |
| Thermo max Q8000 (Shaking Incubator) | Thermo Fisher Scientific | SHKE8000 | |
| Varioskan Lux platereader | Thermo Fisher Scientific | VLBL00GD1 | |
| Vortex Genie 2 | Cole-parmer | OU-04724-05 | |
| VWR PHenomenal pH 1100 L, ph/mv/°c meter | VWR | 662-1657 |
Referências
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