Métodos para Incorporação de Reações de Síntese Proteica Livre de Células em Hidrogéis em Macroescala
Summary
Aqui, apresentamos dois protocolos para incorporar reações de síntese proteica livre de células em matrizes de hidrogel em macroescala sem a necessidade de uma fase líquida externa.
Abstract
As redes genéticas sintéticas fornecem uma plataforma para cientistas e engenheiros projetarem e construírem novos sistemas com funcionalidade codificada em nível genético. Enquanto o paradigma dominante para a implantação de redes gênicas está dentro de um chassi celular, redes gênicas sintéticas também podem ser implantadas em ambientes livres de células. Aplicações promissoras de redes gênicas livres de células incluem biossensores, já que esses dispositivos foram demonstrados contra alvos bióticos (vírus Ebola, Zika e SARS-CoV-2) e abióticos (metais pesados, sulfetos, pesticidas e outros contaminantes orgânicos). Sistemas livres de células são tipicamente implantados na forma líquida dentro de um vaso de reação. Ser capaz de incorporar tais reações em uma matriz física, no entanto, pode facilitar sua aplicação mais ampla em um conjunto mais amplo de ambientes. Para este fim, métodos para incorporar reações de síntese proteica livre de células (CFPS) em uma variedade de matrizes de hidrogel têm sido desenvolvidos. Uma das principais propriedades dos hidrogéis propícios a este trabalho é a alta capacidade de reconstituição de água dos materiais hidrogéis. Além disso, os hidrogéis possuem características físicas e químicas funcionalmente benéficas. Os hidrogéis podem ser liofilizados para armazenamento e reidratados para uso posterior. Dois protocolos passo-a-passo para a inclusão e ensaio de reações de CFPS em hidrogéis são apresentados. Primeiro, um sistema CFPS pode ser incorporado a um hidrogel via reidratação com um lisado celular. O sistema dentro do hidrogel pode então ser induzido ou expresso constitutivamente para a expressão completa de proteínas através do hidrogel. Em segundo lugar, o lisado celular pode ser introduzido em um hidrogel no ponto de polimerização, e todo o sistema pode ser liofilizado e reidratado em um ponto posterior com uma solução aquosa contendo o indutor para o sistema de expressão codificado dentro do hidrogel. Esses métodos têm o potencial de permitir redes gênicas livres de células que conferem capacidades sensoriais a materiais hidrogéis, com potencial para implantação além do laboratório.
Introduction
A biologia sintética integra diversas disciplinas de engenharia para projetar e projetar peças, dispositivos e sistemas de base biológica que podem executar funções que não são encontradas na natureza. A maioria das abordagens da biologia sintética ainda está ligada a células vivas. Por outro lado, sistemas de biologia sintética livres de células facilitam níveis sem precedentes de controle e liberdade no projeto, permitindo maior flexibilidade e um tempo reduzido para a engenharia de sistemas biológicos, ao mesmo tempo em que eliminam muitas das restrições dos métodos tradicionais de expressão gênica baseados em células 1,2,3. A CFPS está sendo usada em um número crescente de aplicações em várias disciplinas, incluindo a construção de células artificiais, prototipagem de circuitos genéticos, desenvolvimento de biossensores e produção de metabólitos 4,5,6. A SDFC também tem sido particularmente útil para a produção de proteínas recombinantes que não podem ser prontamente expressas em células vivas, como proteínas propensas à agregação, proteínas transmembrana e proteínas tóxicas 6,7,8.
A CFPS é tipicamente realizada em reações líquidas. Isso, no entanto, pode restringir sua implantação em algumas situações, já que qualquer dispositivo livre de células líquidas deve estar contido dentro de um recipiente de reação. A justificativa para o desenvolvimento dos métodos aqui apresentados foi fornecer protocolos robustos para incorporar dispositivos de biologia sintética livres de células em hidrogéis, não como uma plataforma de produção de proteínas em si, mas, em vez disso, permitir o uso de hidrogéis como um chassi físico para a implantação de dispositivos livres de células além do laboratório. O uso de hidrogéis como chassi CFPS tem várias vantagens. Os hidrogéis são materiais poliméricos que, apesar de apresentarem alto teor de água (às vezes superior a 98%), possuem propriedades sólidas 9,10,11. Têm uso como pastas, lubrificantes e adesivos e estão presentes em produtos tão diversos como lentes de contato, curativos, fitas adesivas marinhas, corretivos de solo e fraldas infantis 9,11,12,13,14. Os hidrogéis também estão sob investigação ativa como veículos de entrega de drogas 9,15,16,17. Os hidrogéis também podem ser biocompatíveis, biodegradáveis e possuir respostas a estímulos próprios9,18,19,20. Portanto, o objetivo aqui é criar uma sinergia entre a funcionalidade derivada da biologia molecular e a ciência dos materiais. Para tanto, esforços têm sido feitos para integrar a biologia sintética livre de células com uma variedade de materiais, incluindo colágeno, laponita, poliacrilamida, fibrina, peptídeo PEG e agarose 11,21,22, bem como para revestir superfícies de vidro, papel e pano11,23,24 com dispositivos CFPS. Os protocolos aqui apresentados demonstram dois métodos para incorporar reações CFPS em matrizes de hidrogel em macroescala (i.e., >1 mm), usando agarose como material exemplar. A agarose foi escolhida devido à sua alta capacidade de absorção de água, propriedades autogelificantes controladas e propriedades mecânicas ajustáveis 11,24,25,26. Agarose também suporta CFPS funcional, é mais barato do que muitas outras alternativas de hidrogel, e é biodegradável, tornando-se uma escolha atraente como um sistema modelo experimental. Esses métodos, no entanto, foram previamente demonstrados como apropriados para incorporar CFPS em uma variedade de hidrogéis alternativos11. Considerando a ampla gama de aplicações dos hidrogéis e a funcionalidade da CFPS, os métodos aqui demonstrados podem fornecer uma base a partir da qual os pesquisadores são capazes de desenvolver materiais hidrogéis biologicamente aprimorados adequados aos seus próprios fins.
Em estudos anteriores, sistemas de microgel com faixa de tamanho de 1 μm a 400 μm foram utilizados para realizar CFPS em hidrogéis submersos em tampão de reação 23,27,28,29,30,31. A exigência de submergir hidrogéis dentro de tampões de reação CFPS, no entanto, limita as oportunidades para sua implantação como materiais por direito próprio. Os protocolos aqui apresentados permitem que as reações de CFPS ocorram dentro de hidrogéis sem a necessidade de submergir os géis em tampões de reação. Em segundo lugar, o uso de géis de macroescala (entre 2 mm e 10 mm de tamanho) permite o estudo da interação física entre hidrogéis e expressão gênica livre de células. Por exemplo, com essa técnica, é possível estudar como a matriz de hidrogel afeta as reações de CFPS11 e como as reações de CFPS podem afetar a matriz de hidrogel31. Tamanhos maiores de hidrogéis também permitem o desenvolvimento de novos materiais bioprogramáveis32. Finalmente, ao incorporar reações CFPS em hidrogéis, há também uma redução potencial na necessidade de vasos de reação plástica. Para a implantação de sensores sem células, isso tem vantagens claras sobre dispositivos dependentes de plásticos. Em conjunto, a incorporação de reações CFPS em hidrogéis fornece várias vantagens para a implantação de dispositivos livres de células além do laboratório.
O objetivo geral dos métodos aqui apresentados é permitir a operação de reações CFPS dentro de matrizes de hidrogel. Dois métodos diferentes são demonstrados para incorporar reações de produção de proteínas livres de células em materiais hidrogéis em macroescala (Figura 1). No Método A, componentes CFPS são introduzidos em hidrogéis de agarose liofilizados para formar um sistema ativo. No método B, a agarose fundida é misturada com componentes da reação CFPS para formar um sistema completo de hidrogel CFPS, que é então liofilizado e armazenado até que seja necessário. Estes sistemas podem ser reidratados com um volume de água ou tampão e analito para iniciar a reação.
Este estudo utiliza sistemas baseados em lisado celular de Escherichia coli . Estes são alguns dos sistemas CFPS experimentais mais populares, pois a preparação de lisado celular de E. coli é simples, barata e alcança altos rendimentos proteicos. O lisado celular é complementado com os componentes macromoleculares necessários para realizar a transcrição e tradução, incluindo ribossomos, RNAt, aminoacil-tRNA sintetases e fatores de iniciação, alongamento e terminação. Especificamente, este trabalho demonstra a produção de eGFP e mCherry em hidrogéis de agarose usando lisados celulares de E. coli e monitora a aparência da fluorescência usando um leitor de placas e microscopia confocal. Resultados representativos para o leitor de placas de microtitulação podem ser vistos em Whitfield et al.31, e os dados subjacentes estão disponíveis publicamente33. Além disso, a expressão de proteínas fluorescentes através dos géis é confirmada usando microscopia confocal. Os dois protocolos demonstrados neste trabalho permitem a montagem e armazenamento de dispositivos genéticos baseados em CFPS em matéria com o objetivo final de criar um ambiente físico adequado para a distribuição de circuitos gênicos livres de células de forma a apoiar a implantação em campo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui são descritos dois protocolos para a incorporação de reações CFPS baseadas em lisado celular de E. coli em hidrogéis de agarose. Esses métodos permitem a expressão gênica simultânea em todo o material. O protocolo pode ser adaptado para outros sistemas CFPS e tem sido conduzido com sucesso com kits CFPS disponíveis comercialmente, além dos lisados celulares preparados em laboratório detalhados aqui. É importante ressaltar que o protocolo permite a expressão gênica na ausência de uma fase l?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem imensamente o apoio dos prêmios BB/V017551/1 (S.K., T.P.H.) e BB/W01095X/1 (A.L., T.P.H.) e EP/N026683/1 (A.L., T.P.H.) do Conselho de Pesquisa em Engenharia e Ciências Físicas – Laboratórios de Ciência e Tecnologia de Defesa (C.J.W., A.M.B., T.P.H.). Os dados que suportam esta publicação estão disponíveis em: 10.25405/data.ncl.22232452. Para fins de acesso aberto, o autor aplicou uma licença Creative Commons Attribution (CC BY) a qualquer versão do Autor Aceito do Manuscrito que surgir.
Materials
| Material | |||
| 3-PGA | Santa Cruz Biotechnology | sc-214793B | |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Agar | Thermo Fisher Scientific | A10752.22 | |
| Agarose | Severn Biotech | 30-15-50 | |
| Amino Acid Sampler Kit | VWR | BTRABR1401801 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A8937-1G | |
| cAMP | Sigma-Aldrich | A9501-1G | |
| Coenzyme A (CoA) | Sigma-Aldrich | C4282-100MG | |
| CTP | Alfa Aesar | J14121.MC | |
| DTT | Thermo Fisher Scientific | R0862 | |
| Folinic Acid | Sigma-Aldrich | F7878-100MG | |
| GTP | Carbosynth | NG01208 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-25G | |
| K-glutamate | Sigma-Aldrich | G1149-100G | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876-1G | |
| Mg-glutamate | Sigma-Aldrich | 49605-250G | |
| NAD | Sigma-Aldrich | N6522-250MG | |
| PEG-8000 | Promega | V3011 | |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 757551-5G | |
| Potassium Phosphate Dibasic (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | P3786-500G | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | RDD037-500G | |
| Protease Inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P2714-1BTL | |
| Qubit Protein concentration kit | Thermo Fisher Scientific | A50668 | |
| Rossetta 2 DE 3 E.coli | Sigma-Aldrich | 71397-3 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888-500G | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | 85558-1G | |
| Tryptone | Thermo Fisher Scientific | 211705 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | GE17-1321-01 | |
| tRNA | Sigma-Aldrich | 10109541001 | |
| UTP | Alfa Aesar | J23160.MC | |
| Yeast Extract | Sigma-Aldrich | Y1625-1KG | |
| Equipment | |||
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | HS4323-500EA | |
| 10K MWCO dialysis cassettes | Thermo Fisher Scientific | 66381 | |
| 15 mL centrifuge tube | Sarstedt | 62.554.502 | |
| 50 mL centrifuge bottles | Sarstedt | 62.547.254 | |
| 500 mL centrifuge bottles | Thermo Fisher Scientific | 3120-9500 | |
| Alpha 1-2 LD Plus freeze-dryer | Christ | part no. 101521, 101522, 101527 | |
| Benchtop Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | H-X3R | |
| Black 384 well microtitre plates | Fischer Scientific | 66 | |
| Cuvettes | Thermo Fisher Scientific | 222S | |
| Elga Purelab Chorus | Elga | ##### | |
| Eppendorf Microcentrifuge 5425R | Eppendorf | EP00532 | |
| High Speed Centrifuge | Beckman Coulter | B34183 | |
| JMP license | SAS Institute | 15 | |
| Magnetic Stirrer | Fischer Scientific | 15353518 | |
| Parafilm | Amcor | PM-966 | |
| Photospectrometer (Biophotometer) | Eppendorf | 16713 | |
| Pipettes and tips | Gilson | ##### | |
| Precision Balance | Sartorius | 16384738 | |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q32866 | |
| Shaking Incubator | Thermo Fisher Scientific | SHKE8000 | |
| Sonic Dismembrator (Sonicator) | Thermo Fisher Scientific | 12893543 | |
| Static Incubator | Sanyo | MIR-162 | |
| Syringe and needles | Thermo Fisher Scientific | 66490 | |
| Thermo max Q8000 (Shaking Incubator) | Thermo Fisher Scientific | SHKE8000 | |
| Varioskan Lux platereader | Thermo Fisher Scientific | VLBL00GD1 | |
| Vortex Genie 2 | Cole-parmer | OU-04724-05 | |
| VWR PHenomenal pH 1100 L, ph/mv/°c meter | VWR | 662-1657 |
Referências
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