Métodos para incorporar reacciones de síntesis de proteínas libres de células en hidrogeles a macroescala
Summary
Aquí, presentamos dos protocolos para incrustar reacciones de síntesis de proteínas libres de células en matrices de hidrogel a macroescala sin la necesidad de una fase líquida externa.
Abstract
Las redes de genes sintéticos proporcionan una plataforma para que los científicos e ingenieros diseñen y construyan sistemas novedosos con funcionalidad codificada a nivel genético. Si bien el paradigma dominante para el despliegue de redes de genes se encuentra dentro de un chasis celular, las redes de genes sintéticos también pueden desplegarse en entornos libres de células. Entre las aplicaciones prometedoras de las redes de genes libres de células se encuentran los biosensores, ya que se ha demostrado que estos dispositivos se encuentran contra objetivos bióticos (virus del Ébola, Zika y SARS-CoV-2) y abióticos (metales pesados, sulfuros, pesticidas y otros contaminantes orgánicos). Los sistemas libres de células generalmente se implementan en forma líquida dentro de un recipiente de reacción. Sin embargo, ser capaz de incrustar tales reacciones en una matriz física puede facilitar su aplicación más amplia en un conjunto más amplio de entornos. Con este fin, se han desarrollado métodos para incorporar reacciones de síntesis de proteínas libres de células (CFPS) en una variedad de matrices de hidrogel. Una de las propiedades clave de los hidrogeles que conducen a este trabajo es la alta capacidad de reconstitución en agua de los materiales de hidrogel. Además, los hidrogeles poseen características físicas y químicas que son funcionalmente beneficiosas. Los hidrogeles se pueden liofilizar para su almacenamiento y rehidratarse para su uso posterior. Se presentan dos protocolos paso a paso para la inclusión y el ensayo de reacciones de CFPS en hidrogeles. En primer lugar, se puede incorporar un sistema CFPS a un hidrogel mediante rehidratación con un lisado celular. El sistema dentro del hidrogel puede ser inducido o expresado constitutivamente para una expresión completa de proteínas a través del hidrogel. En segundo lugar, el lisado celular se puede introducir en un hidrogel en el punto de polimerización, y todo el sistema se puede liofilizar y rehidratar en un punto posterior con una solución acuosa que contiene el inductor del sistema de expresión codificado dentro del hidrogel. Estos métodos tienen el potencial de permitir redes de genes libres de células que confieren capacidades sensoriales a los materiales de hidrogel, con el potencial de ser desplegados más allá del laboratorio.
Introduction
La biología sintética integra diversas disciplinas de ingeniería para diseñar y diseñar piezas, dispositivos y sistemas de base biológica que puedan realizar funciones que no se encuentran en la naturaleza. La mayoría de los enfoques de biología sintética todavía están ligados a células vivas. Por el contrario, los sistemas de biología sintética libres de células facilitan niveles sin precedentes de control y libertad en el diseño, lo que permite una mayor flexibilidad y un tiempo más corto para la ingeniería de sistemas biológicos, al tiempo que elimina muchas de las limitaciones de los métodos tradicionales de expresión génica basados en células 1,2,3. El CFPS se utiliza en un número cada vez mayor de aplicaciones en numerosas disciplinas, incluida la construcción de células artificiales, la creación de prototipos de circuitos genéticos, el desarrollo de biosensores y la producción de metabolitos 4,5,6. El CFPS también ha sido particularmente útil para producir proteínas recombinantes que no pueden expresarse fácilmente en células vivas, como las proteínas propensas a la agregación, las proteínas transmembrana y las proteínas tóxicas 6,7,8.
El CFPS se realiza normalmente en reacciones líquidas. Esto, sin embargo, puede restringir su despliegue en algunas situaciones, ya que cualquier dispositivo líquido libre de células debe estar contenido dentro de un recipiente de reacción. La justificación para el desarrollo de los métodos presentados aquí fue proporcionar protocolos sólidos para incrustar dispositivos de biología sintética libres de células en hidrogeles, no como una plataforma de producción de proteínas per se, sino para permitir el uso de hidrogeles como un chasis físico para el despliegue de dispositivos libres de células más allá del laboratorio. El uso de hidrogeles como chasis de CFPS tiene varias ventajas. Los hidrogeles son materiales poliméricos que, a pesar de un alto contenido de agua (a veces superior al 98%), poseen propiedades sólidas 9,10,11. Tienen usos como pastas, lubricantes y adhesivos y están presentes en productos tan diversos como lentes de contacto, apósitos para heridas, cintas adhesivas marinas, enmiendas de suelo y pañales para bebés 9,11,12,13,14. Los hidrogeles también están siendo investigados activamente como vehículos de administración de fármacos 9,15,16,17. Los hidrogeles también pueden ser biocompatibles, biodegradables y poseer algunas respuestas a estímulos propios 9,18,19,20. Por lo tanto, el objetivo aquí es crear una sinergia entre la funcionalidad derivada de la biología molecular y la ciencia de los materiales. Con este fin, se han realizado esfuerzos para integrar la biología sintética libre de células con una variedad de materiales, incluidos el colágeno, la laponita, la poliacrilamida, la fibrina, el péptido PEG y la agarosa 11,21,22, así como para recubrir superficies de vidrio, papel y tela 11,23,24 con dispositivos CFPS. Los protocolos presentados aquí demuestran dos métodos para incrustar reacciones de CFPS en matrices de hidrogel a macroescala (es decir, >1 mm), utilizando agarosa como material de ejemplo. La agarosa fue elegida debido a su alta capacidad de absorción de agua, propiedades autogelificantes controladas y propiedades mecánicas sintonizables 11,24,25,26. La agarosa también es compatible con CFPS funcionales, es más barata que muchas otras alternativas de hidrogel y es biodegradable, lo que la convierte en una opción atractiva como sistema modelo experimental. Sin embargo, se ha demostrado previamente que estos métodos son apropiados para incorporar CFPS en una gama de hidrogeles alternativos11. Teniendo en cuenta la amplia gama de aplicaciones de los hidrogeles y la funcionalidad de los CFPS, los métodos aquí demostrados pueden proporcionar una base a partir de la cual los investigadores puedan desarrollar materiales de hidrogel biológicamente mejorados adecuados para sus propios fines.
En estudios previos, se han utilizado sistemas de microgel con un rango de tamaño de 1 μm a 400 μm para realizar CFPS en hidrogeles sumergidos en tampón de reacción 23,27,28,29,30,31. Sin embargo, el requisito de sumergir los hidrogeles dentro de tampones de reacción de CFPS limita las oportunidades para su uso como materiales por derecho propio. Los protocolos presentados aquí permiten que las reacciones de CFPS ocurran dentro de los hidrogeles sin la necesidad de sumergir los geles en tampones de reacción. En segundo lugar, el uso de geles a macroescala (entre 2 mm y 10 mm de tamaño) permite el estudio de la interacción física entre los hidrogeles y la expresión génica libre de células. Por ejemplo, con esta técnica, es posible estudiar cómo la matriz de hidrogel afecta a las reacciones de CFPS11 y cómo las reacciones de CFPS pueden afectar a la matriz de hidrogel31. Los tamaños más grandes de los hidrogeles también permiten el desarrollo de nuevos materiales bioprogramables32. Por último, al incorporar las reacciones de CFPS en los hidrogeles, también se reduce potencialmente la necesidad de recipientes de reacción de plástico. Para el despliegue de sensores sin células, esto tiene claras ventajas sobre los dispositivos que dependen de los artículos de plástico. En conjunto, la incorporación de reacciones de CFPS en hidrogeles proporciona varias ventajas para el despliegue de dispositivos libres de células más allá del laboratorio.
El objetivo general de los métodos presentados aquí es permitir el funcionamiento de las reacciones de CFPS dentro de matrices de hidrogel. Se muestran dos métodos diferentes para incluir reacciones de producción de proteínas libres de células en materiales de hidrogel a macroescala (Figura 1). En el Método A, los componentes de CFPS se introducen en hidrogeles de agarosa liofilizados para formar un sistema activo. En el Método B, la agarosa fundida se mezcla con los componentes de la reacción CFPS para formar un sistema completo de hidrogel CFPS, que luego se liofiliza y se almacena hasta que se necesita. Estos sistemas se pueden rehidratar con un volumen de agua o tampón y analito para comenzar la reacción.
Este estudio utiliza sistemas basados en lisado de células de Escherichia coli. Estos son algunos de los sistemas experimentales de CFPS más populares, ya que la preparación del lisado de células de E. coli es simple, económica y logra altos rendimientos proteicos. El lisado celular se complementa con los componentes macromoleculares necesarios para realizar la transcripción y la traducción, incluidos los ribosomas, los ARNt, las aminoacil-ARNt sintetasas y los factores de iniciación, elongación y terminación. En concreto, en este trabajo se demuestra la producción de eGFP y mCherry en hidrogeles de agarosa utilizando lisados de células de E. coli y se monitoriza la aparición de fluorescencia mediante un lector de placas y microscopía confocal. Los resultados representativos para el lector de placas de microtitulación se pueden ver en Whitfield et al.31, y los datos subyacentes están disponibles públicamente 33. Además, la expresión de proteínas fluorescentes a través de los geles se confirma mediante microscopía confocal. Los dos protocolos demostrados en este artículo permiten el ensamblaje y almacenamiento de dispositivos genéticos basados en CFPS en materia con el objetivo final de crear un entorno físico adecuado para la distribución de circuitos de genes libres de células de una manera que apoye el despliegue pt el campo.
Protocol
Representative Results
Discussion
A continuación se describen dos protocolos para la incorporación de reacciones de CFPS basadas en lisado de células de E. coli en hidrogeles de agarosa. Estos métodos permiten la expresión génica simultánea en todo el material. El protocolo se puede adaptar a otros sistemas de CFPS y se ha llevado a cabo con éxito con kits de CFPS disponibles en el mercado, además de los lisados celulares preparados en laboratorio que se detallan aquí. Es importante destacar que el protocolo permite la expresión géni…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen enormemente el apoyo de los premios BB/V017551/1 (S.K., T.P.H.) y BB/W01095X/1 (A.L., T.P.H.), y del Consejo de Investigación de Ingeniería y Ciencias Físicas – Laboratorios de Ciencia y Tecnología de Defensa EP/N026683/1 (C.J.W., A.M.B., T.P.H.). Los datos que respaldan esta publicación están disponibles en abierto en: 10.25405/data.ncl.22232452. A los efectos del acceso abierto, el autor ha aplicado una licencia Creative Commons Attribution (CC BY) a cualquier versión del Manuscrito Aceptado por el Autor que surja.
Materials
| Material | |||
| 3-PGA | Santa Cruz Biotechnology | sc-214793B | |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Agar | Thermo Fisher Scientific | A10752.22 | |
| Agarose | Severn Biotech | 30-15-50 | |
| Amino Acid Sampler Kit | VWR | BTRABR1401801 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A8937-1G | |
| cAMP | Sigma-Aldrich | A9501-1G | |
| Coenzyme A (CoA) | Sigma-Aldrich | C4282-100MG | |
| CTP | Alfa Aesar | J14121.MC | |
| DTT | Thermo Fisher Scientific | R0862 | |
| Folinic Acid | Sigma-Aldrich | F7878-100MG | |
| GTP | Carbosynth | NG01208 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-25G | |
| K-glutamate | Sigma-Aldrich | G1149-100G | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876-1G | |
| Mg-glutamate | Sigma-Aldrich | 49605-250G | |
| NAD | Sigma-Aldrich | N6522-250MG | |
| PEG-8000 | Promega | V3011 | |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 757551-5G | |
| Potassium Phosphate Dibasic (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | P3786-500G | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | RDD037-500G | |
| Protease Inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P2714-1BTL | |
| Qubit Protein concentration kit | Thermo Fisher Scientific | A50668 | |
| Rossetta 2 DE 3 E.coli | Sigma-Aldrich | 71397-3 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888-500G | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | 85558-1G | |
| Tryptone | Thermo Fisher Scientific | 211705 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | GE17-1321-01 | |
| tRNA | Sigma-Aldrich | 10109541001 | |
| UTP | Alfa Aesar | J23160.MC | |
| Yeast Extract | Sigma-Aldrich | Y1625-1KG | |
| Equipment | |||
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | HS4323-500EA | |
| 10K MWCO dialysis cassettes | Thermo Fisher Scientific | 66381 | |
| 15 mL centrifuge tube | Sarstedt | 62.554.502 | |
| 50 mL centrifuge bottles | Sarstedt | 62.547.254 | |
| 500 mL centrifuge bottles | Thermo Fisher Scientific | 3120-9500 | |
| Alpha 1-2 LD Plus freeze-dryer | Christ | part no. 101521, 101522, 101527 | |
| Benchtop Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | H-X3R | |
| Black 384 well microtitre plates | Fischer Scientific | 66 | |
| Cuvettes | Thermo Fisher Scientific | 222S | |
| Elga Purelab Chorus | Elga | ##### | |
| Eppendorf Microcentrifuge 5425R | Eppendorf | EP00532 | |
| High Speed Centrifuge | Beckman Coulter | B34183 | |
| JMP license | SAS Institute | 15 | |
| Magnetic Stirrer | Fischer Scientific | 15353518 | |
| Parafilm | Amcor | PM-966 | |
| Photospectrometer (Biophotometer) | Eppendorf | 16713 | |
| Pipettes and tips | Gilson | ##### | |
| Precision Balance | Sartorius | 16384738 | |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q32866 | |
| Shaking Incubator | Thermo Fisher Scientific | SHKE8000 | |
| Sonic Dismembrator (Sonicator) | Thermo Fisher Scientific | 12893543 | |
| Static Incubator | Sanyo | MIR-162 | |
| Syringe and needles | Thermo Fisher Scientific | 66490 | |
| Thermo max Q8000 (Shaking Incubator) | Thermo Fisher Scientific | SHKE8000 | |
| Varioskan Lux platereader | Thermo Fisher Scientific | VLBL00GD1 | |
| Vortex Genie 2 | Cole-parmer | OU-04724-05 | |
| VWR PHenomenal pH 1100 L, ph/mv/°c meter | VWR | 662-1657 |
Referências
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