Hücresiz Protein Sentezi Reaksiyonlarını Makro Ölçekli Hidrojellere Gömme Yöntemleri
Summary
Burada, hücresiz protein sentezi reaksiyonlarını harici bir sıvı faza ihtiyaç duymadan makro ölçekli hidrojel matrislerine gömmek için iki protokol sunuyoruz.
Abstract
Sentetik gen ağları, bilim insanlarının ve mühendislerin genetik düzeyde kodlanmış işlevselliğe sahip yeni sistemler tasarlamaları ve inşa etmeleri için bir platform sağlar. Gen ağlarının konuşlandırılması için baskın paradigma hücresel bir şasi içinde olsa da, sentetik gen ağları hücresiz ortamlarda da konuşlandırılabilir. Hücresiz gen ağlarının umut verici uygulamaları arasında biyosensörler bulunur, çünkü bu cihazlar biyotik (Ebola, Zika ve SARS-CoV-2 virüsleri) ve abiyotik (ağır metaller, sülfürler, böcek ilaçları ve diğer organik kirleticiler) hedeflere karşı gösterilmiştir. Hücresiz sistemler tipik olarak bir reaksiyon kabı içinde sıvı halde konuşlandırılır. Bununla birlikte, bu tür reaksiyonları fiziksel bir matrise gömmek, daha geniş bir ortam kümesinde daha geniş uygulamalarını kolaylaştırabilir. Bu amaçla, hücresiz protein sentezi (CFPS) reaksiyonlarını çeşitli hidrojel matrislerine gömmek için yöntemler geliştirilmiştir. Bu çalışmaya elverişli hidrojellerin temel özelliklerinden biri, hidrojel malzemelerin yüksek su sulandırma kapasitesidir. Ek olarak, hidrojeller, işlevsel olarak faydalı olan fiziksel ve kimyasal özelliklere sahiptir. Hidrojeller, depolama için dondurularak kurutulabilir ve daha sonra kullanılmak üzere yeniden sulandırılabilir. CFPS reaksiyonlarının hidrojellere dahil edilmesi ve tahlili için iki adım adım protokol sunulmaktadır. İlk olarak, bir CFPS sistemi, bir hücre lizatı ile rehidrasyon yoluyla bir hidrojele dahil edilebilir. Hidrojel içindeki sistem daha sonra hidrojel yoluyla tam protein ekspresyonu için yapısal olarak indüklenebilir veya eksprese edilebilir. İkincisi, hücre lizatı, polimerizasyon noktasında bir hidrojele eklenebilir ve tüm sistem, hidrojel içinde kodlanan ekspresyon sistemi için indükleyiciyi içeren sulu bir çözelti ile daha sonraki bir noktada dondurularak kurutulabilir ve yeniden sulandırılabilir. Bu yöntemler, hidrojel malzemelere duyusal yetenekler kazandıran hücresiz gen ağlarına izin verme potansiyeline sahiptir ve laboratuvarın ötesinde konuşlanma potansiyeline sahiptir.
Introduction
Sentetik biyoloji, doğada bulunmayan işlevleri yerine getirebilen biyolojik tabanlı parçalar, cihazlar ve sistemler tasarlamak ve tasarlamak için çeşitli mühendislik disiplinlerini bütünleştirir. Çoğu sentetik biyoloji yaklaşımı hala canlı hücrelere bağlıdır. Buna karşılık, hücresiz sentetik biyoloji sistemleri, geleneksel hücre tabanlı gen ekspresyon yöntemlerininkısıtlamalarının çoğunu ortadan kaldırırken, biyolojik sistemlerin mühendisliği için daha fazla esneklik ve kısaltılmış bir süre sağlayarak, tasarımda benzeri görülmemiş düzeyde kontrol ve özgürlüğü kolaylaştırır 1,2,3. CFPS, yapay hücreler oluşturmak, genetik devrelerin prototipini oluşturmak, biyosensörler geliştirmek ve metabolitler üretmek de dahil olmak üzere çok sayıda disiplinde artan sayıda uygulamada kullanılmaktadır 4,5,6. CFPS ayrıca, agregasyona eğilimli proteinler, transmembran proteinler ve toksik proteinler 6,7,8 gibi canlı hücrelerde kolayca eksprese edilemeyen rekombinant proteinlerin üretilmesi için özellikle yararlı olmuştur.
CFPS tipik olarak sıvı reaksiyonlarda gerçekleştirilir. Bununla birlikte, bu, herhangi bir sıvı hücresiz cihazın bir reaksiyon kabı içinde bulunması gerektiğinden, bazı durumlarda konuşlandırılmalarını kısıtlayabilir. Burada sunulan yöntemlerin geliştirilmesinin gerekçesi, hücresiz sentetik biyoloji cihazlarının hidrojellere gömülmesi için sağlam protokoller sağlamaktı, kendi başına bir protein üretim platformu olarak değil, bunun yerine, hidrojellerin hücresiz cihazların laboratuvarın ötesinde konuşlandırılması için fiziksel bir şasi olarak kullanılmasına izin vermekti. Hidrojellerin CFPS şasisi olarak kullanılmasının çeşitli avantajları vardır. Hidrojeller, yüksek su içeriğine rağmen (bazen% 98’den fazla), katı özellikleresahip polimerik malzemelerdir 9,10,11. Macunlar, yağlayıcılar ve yapıştırıcılar olarak kullanımları vardır ve kontakt lensler, yara örtüleri, deniz yapışkan bantları, kir iyileştiriciler ve bebek bezleri 9,11,12,13,14 gibi çeşitli ürünlerde bulunurlar. Hidrojeller ayrıca ilaç dağıtım araçlarıolarak aktif olarak araştırılmaktadır 9,15,16,17. Hidrojeller ayrıca biyouyumlu, biyolojik olarak parçalanabilir ve kendi 9,18,19,20 uyaran tepkilerine sahip olabilir. Dolayısıyla buradaki amaç, moleküler biyolojiden türetilen işlevsellik ile malzeme bilimi arasında bir sinerji yaratmaktır. Bu amaçla, hücresiz sentetik biyolojiyi kollajen, laponit, poliakrilamid, fibrin, PEG-peptid ve agaroz 11,21,22 dahil olmak üzere bir dizi malzemeyle entegre etmenin yanı sıra cam, kağıt ve kumaş yüzeylerini kaplamak için çaba sarf edilmiştir 11,23,24 CFPS cihazları ile. Burada sunulan protokoller, örnek malzeme olarak agaroz kullanılarak CFPS reaksiyonlarını makro ölçekli (yani >1 mm) hidrojel matrislerine gömmek için iki yöntemi göstermektedir. Agaroz, yüksek su emme kapasitesi, kontrollü kendi kendine jelleşme özellikleri ve ayarlanabilir mekanik özelliklerinedeniyle seçilmiştir 11,24,25,26. Agarose ayrıca fonksiyonel CFPS’yi destekler, diğer birçok hidrojel alternatifinden daha ucuzdur ve biyolojik olarak parçalanabilir, bu da onu deneysel bir model sistem olarak çekici bir seçim haline getirir. Bununla birlikte, bu yöntemlerin daha önce CFPS’yi bir dizi alternatif hidrojele gömmek için uygun olduğu gösterilmiştir11. Hidrojellerin geniş uygulama yelpazesi ve CFPS’nin işlevselliği göz önüne alındığında, burada gösterilen yöntemler, araştırmacıların kendi amaçlarına uygun biyolojik olarak geliştirilmiş hidrojel malzemeleri geliştirebilecekleri bir temel sağlayabilir.
Önceki çalışmalarda,23,27,28,29,30,31 reaksiyon tamponuna batırılmış hidrojellerde CFPS gerçekleştirmek için 1 μm ila 400 μm boyut aralığına sahip mikrojel sistemleri kullanılmıştır. Bununla birlikte, hidrojelleri CFPS reaksiyon tamponlarına daldırma gerekliliği, kendi başlarına malzeme olarak konuşlandırılma fırsatlarını sınırlar. Burada sunulan protokoller, jelleri reaksiyon tamponlarına daldırmaya gerek kalmadan hidrojeller içinde CFPS reaksiyonlarının gerçekleşmesine izin verir. İkincisi, makro ölçekli jellerin (2 mm ila 10 mm boyutunda) kullanılması, hidrojeller ve hücresiz gen ekspresyonu arasındaki fiziksel etkileşimin incelenmesine izin verir. Örneğin, bu teknikle, hidrojel matrisinin CFPS reaksiyonlarını11 nasıl etkilediğini ve CFPS reaksiyonlarının hidrojel matrisini31 nasıl etkileyebileceğini incelemek mümkündür. Daha büyük boyutlardaki hidrojeller ayrıca yeni, biyo-programlanabilir malzemelerin geliştirilmesine de izin verir32. Son olarak, CFPS reaksiyonlarını hidrojellere gömerek, plastik reaksiyon kaplarına olan gereksinimde de potansiyel bir azalma olur. Hücresiz sensörlerin konuşlandırılması için bu, plastik malzemelere bağımlı cihazlara göre açık avantajlara sahiptir. Birlikte ele alındığında, CFPS reaksiyonlarının hidrojellere gömülmesi, hücresiz cihazların laboratuvarın ötesinde konuşlandırılması için çeşitli avantajlar sağlar.
Burada sunulan yöntemlerin genel amacı, hidrojel matrisleri içinde CFPS reaksiyonlarının çalışmasına izin vermektir. Hücresiz protein üretim reaksiyonlarını makro ölçekli hidrojel malzemelere gömmek için iki farklı yöntem gösterilmiştir (Şekil 1). Yöntem A’da, CFPS bileşenleri, aktif bir sistem oluşturmak için liyofilize agaroz hidrojellere eklenir. Yöntem B’de, erimiş agaroz, tam bir CFPS hidrojel sistemi oluşturmak için CFPS reaksiyon bileşenleri ile karıştırılır, daha sonra liyofilize edilir ve ihtiyaç duyulana kadar depolanır. Bu sistemler, reaksiyonu başlatmak için bir hacim su veya tampon ve analit ile rehidre edilebilir.
Bu çalışmada Escherichia coli hücre lizat bazlı sistemler kullanılmaktadır. E. coli hücre lizat preparatı basit, ucuz ve yüksek protein verimi sağladığı için bunlar en popüler deneysel CFPS sistemlerinden bazılarıdır. Hücre lizatı, ribozomlar, tRNA’lar, aminoasil-tRNA sentetazları ve başlatma, uzama ve sonlandırma faktörleri dahil olmak üzere transkripsiyon ve translasyonu gerçekleştirmek için gereken makromoleküler bileşenlerle tamamlanır. Spesifik olarak, bu makale, E. coli hücre lizatları kullanılarak agaroz hidrojellerde eGFP ve mCherry üretimini gösterir ve bir plaka okuyucu ve konfokal mikroskopi kullanarak floresan görünümünü izler. Mikrotitre plaka okuyucu için temsili sonuçlar Whitfield ve ark.31’de görülebilir ve temel veriler kamuya açıktır 33. Ayrıca, jeller boyunca floresan proteinlerin ekspresyonu konfokal mikroskopi kullanılarak doğrulanır. Bu yazıda gösterilen iki protokol, hücre içermeyen gen devrelerinin saha dağıtımını destekleyecek şekilde dağıtımı için uygun bir fiziksel ortam yaratma nihai hedefi ile CFPS tabanlı genetik cihazların materyalde birleştirilmesine ve depolanmasına izin verir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, E. coli hücresi lizat bazlı CFPS reaksiyonlarının agaroz hidrojellere dahil edilmesi için iki protokol özetlenmiştir. Bu yöntemler, materyal boyunca eşzamanlı gen ekspresyonuna izin verir. Protokol diğer CFPS sistemleri için uyarlanabilir ve burada ayrıntıları verilen laboratuvarda hazırlanmış hücre lizatlarına ek olarak ticari olarak temin edilebilen CFPS kitleri ile başarılı bir şekilde yürütülmüştür. Daha da önemlisi, protokol, harici bir sıvı fazın yokluğunda gen ek…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, Biyoteknoloji ve Biyolojik Bilimler Araştırma Konseyi’nin BB/V017551/1 (S.K., T.P.H.) ve BB/W01095X/1 (A.L., T.P.H.) ve Mühendislik ve Fizik Bilimleri Araştırma Konseyi – Savunma Bilimi ve Teknoloji Laboratuvarları ödülü EP/N026683/1 (C.J.W., A.M.B., T.P.H.) ödüllerinin desteğini büyük ölçüde kabul etmektedir. Bu yayını destekleyen veriler şu adreste açıkça mevcuttur: 10.25405/data.ncl.22232452. Yazar, açık erişim amacıyla, ortaya çıkan herhangi bir Yazar Kabul Edilmiş Makale sürümüne Creative Commons Atıf (CC BY) lisansı uygulamıştır.
Materials
| Material | |||
| 3-PGA | Santa Cruz Biotechnology | sc-214793B | |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Agar | Thermo Fisher Scientific | A10752.22 | |
| Agarose | Severn Biotech | 30-15-50 | |
| Amino Acid Sampler Kit | VWR | BTRABR1401801 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A8937-1G | |
| cAMP | Sigma-Aldrich | A9501-1G | |
| Coenzyme A (CoA) | Sigma-Aldrich | C4282-100MG | |
| CTP | Alfa Aesar | J14121.MC | |
| DTT | Thermo Fisher Scientific | R0862 | |
| Folinic Acid | Sigma-Aldrich | F7878-100MG | |
| GTP | Carbosynth | NG01208 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-25G | |
| K-glutamate | Sigma-Aldrich | G1149-100G | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876-1G | |
| Mg-glutamate | Sigma-Aldrich | 49605-250G | |
| NAD | Sigma-Aldrich | N6522-250MG | |
| PEG-8000 | Promega | V3011 | |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 757551-5G | |
| Potassium Phosphate Dibasic (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | P3786-500G | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | RDD037-500G | |
| Protease Inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P2714-1BTL | |
| Qubit Protein concentration kit | Thermo Fisher Scientific | A50668 | |
| Rossetta 2 DE 3 E.coli | Sigma-Aldrich | 71397-3 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888-500G | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | 85558-1G | |
| Tryptone | Thermo Fisher Scientific | 211705 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | GE17-1321-01 | |
| tRNA | Sigma-Aldrich | 10109541001 | |
| UTP | Alfa Aesar | J23160.MC | |
| Yeast Extract | Sigma-Aldrich | Y1625-1KG | |
| Equipment | |||
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | HS4323-500EA | |
| 10K MWCO dialysis cassettes | Thermo Fisher Scientific | 66381 | |
| 15 mL centrifuge tube | Sarstedt | 62.554.502 | |
| 50 mL centrifuge bottles | Sarstedt | 62.547.254 | |
| 500 mL centrifuge bottles | Thermo Fisher Scientific | 3120-9500 | |
| Alpha 1-2 LD Plus freeze-dryer | Christ | part no. 101521, 101522, 101527 | |
| Benchtop Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | H-X3R | |
| Black 384 well microtitre plates | Fischer Scientific | 66 | |
| Cuvettes | Thermo Fisher Scientific | 222S | |
| Elga Purelab Chorus | Elga | ##### | |
| Eppendorf Microcentrifuge 5425R | Eppendorf | EP00532 | |
| High Speed Centrifuge | Beckman Coulter | B34183 | |
| JMP license | SAS Institute | 15 | |
| Magnetic Stirrer | Fischer Scientific | 15353518 | |
| Parafilm | Amcor | PM-966 | |
| Photospectrometer (Biophotometer) | Eppendorf | 16713 | |
| Pipettes and tips | Gilson | ##### | |
| Precision Balance | Sartorius | 16384738 | |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q32866 | |
| Shaking Incubator | Thermo Fisher Scientific | SHKE8000 | |
| Sonic Dismembrator (Sonicator) | Thermo Fisher Scientific | 12893543 | |
| Static Incubator | Sanyo | MIR-162 | |
| Syringe and needles | Thermo Fisher Scientific | 66490 | |
| Thermo max Q8000 (Shaking Incubator) | Thermo Fisher Scientific | SHKE8000 | |
| Varioskan Lux platereader | Thermo Fisher Scientific | VLBL00GD1 | |
| Vortex Genie 2 | Cole-parmer | OU-04724-05 | |
| VWR PHenomenal pH 1100 L, ph/mv/°c meter | VWR | 662-1657 |
Referências
- Lu, Y. Cell-free synthetic biology: Engineering in an open world. Synthetic and System Biotechnology. 2 (1), 23-27 (2017).
- Perez, J. G., Stark, J. C., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: Engineering beyond the cell. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (12), e023853 (2016).
- Jiang, L., Zhao, J., Lian, J., Xu, Z. Cell-free protein synthesis enabled rapid prototyping for metabolic engineering and synthetic biology. Synthetic and System Biotechnology. 3 (2), 90-96 (2018).
- Kopniczky, M. B., et al. Cell-free protein synthesis as a prototyping platform for mammalian synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 9 (1), 144-156 (2020).
- Pandi, A., Grigoras, I., Borkowski, O., Faulon, J. L. Optimizing cell-free biosensors to monitor enzymatic production. ACS Synthetic Biology. 8 (8), 1952-1957 (2019).
- Khambhati, K., Bhattacharjee, G., Gohil, N., Braddick, D., Kulkarni, V. S. V. Exploring the potential of cell-free protein synthesis for extending the abilities of biological systems. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 248 (2019).
- Focke, P. J., et al. Combining in vitro folding with cell free protein synthesis for membrane protein expression. Bioquímica. 55 (30), 4212-4219 (2016).
- Fogeron, M. L., Lecoq, L., Cole, L., Harbers, M., Böckmann, A. Easy synthesis of complex biomolecular assemblies: wheat germ cell-free protein expression in structural biology. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 63958 (2021).
- Bashir, S., et al. Fundamental concepts of hydrogels: synthesis, properties, and their applications. Polymers. 12 (11), 2702 (2020).
- Loo, S. L., Vásquez, L., Athanassiou, A., Fragouli, D. Polymeric hydrogels-A promising platform in enhancing water security for a sustainable future. Advanced Material Interfaces. 8 (24), 2100580 (2021).
- Whitfield, C. J., et al. Cell-free protein synthesis in hydrogel materials. Chemical Communications. 56 (52), 7108-7111 (2020).
- Yao, H., et al. Design strategies for adhesive hydrogels with natural antibacterial agents as wound dressings: Status and trends. Materials Today Bio. 15, 100429 (2022).
- Musgrave, C. S. A., Fang, F. Contact lens materials: A materials science perspective. Materials. 12 (2), 261 (2019).
- Maher, A. J., Rana, A. G., Rawan, A. Recovery of hydrogel from baby diaper wastes and its application for enhancing soil irrigation management. Journal of Environmental Management. 239, 255-261 (2019).
- Vigata, M., Meinert, C., Hutmacher, D. W., Bock, N. Hydrogels as drug delivery systems: A review of current characterization and evaluation techniques. Pharmaceutics. 12 (12), 1188 (2020).
- Jacob, S., et al. Emerging role of hydrogels in drug delivery systems, tissue engineering and wound management. Pharmaceutics. 3 (3), 357 (2021).
- Senapati, S., et al. Controlled drug delivery vehicles for cancer treatment and their performance. Signal Transduction and Targeted Therapy. 3, 7 (2018).
- Chen, Y., et al. A biocompatible, stimuli-responsive, and injectable hydrogel with triple dynamic bonds. Molecules. 25 (13), 3050 (2020).
- Shi, Q., et al. Bioactuators based on stimulus-responsive hydrogels and their emerging biomedical applications. NPG Asia Materials. 11, 64 (2019).
- Fan, M., Tan, H. Biocompatible conjugation for biodegradable hydrogels as drug and cell scaffolds. Cogent Engineering. 7 (1), 1736407 (2020).
- Byun, J. Y., Lee, K. H., Lee, K. Y., Kim, M. G., Kim, D. M. In-gel expression and in situ immobilization of proteins for generation of three-dimensional protein arrays in a hydrogel matrix. Lab on a Chip. 13 (5), 886-891 (2013).
- Zhou, X., Wu, H., Cui, M., Lai, S. N., Zheng, B. Long-lived protein expression in hydrogel particles: Towards artificial cells. Chemical Science. 9 (18), 4275-4279 (2018).
- Huang, A., et al. BiobitsTM explorer: A modular synthetic biology education kit. Science Advances. 4 (8), 5105 (2018).
- Jaramillo-Isaza, S., Alfonso-Rodriguez, C. A., Rios-Rojas, J. F., García-Guzmán, J. A. Dynamic mechanical analysis of agarose-based biopolymers with potential use in regenerative medicine. Materials Today Proceeding. 49, 16-22 (2022).
- Wang, B. X., Xu, W., Yang, Z., Wu, Y. An overview on recent progress of the hydrogels: from material resources, properties to functional applications. Macromolecular Rapid Communications. 43 (6), 2100785 (2022).
- Salati, M. A., et al. Agarose-based biomaterials: Opportunities and challenges in cartilage tissue engineering. Polymers. 12 (5), 1150 (2020).
- Buddingh, B. C., Van Hest, J. C. M. Artificial cells: Synthetic compartments with life-like functionality and adaptivity. Accounts of Chemical Research. 50 (4), 769-777 (2017).
- Kahn, J. S., et al. DNA microgels as a platform for cell-free protein expression and display. Biomacromolecules. 17 (6), 2019-2026 (2016).
- Yang, D., et al. Enhanced transcription and translation in clay hydrogel and implications for early life evolution. Scientific Reports. 3, 3165 (2013).
- Zhou, X., Wu, H., Cui, M., Lai, S. N., Zheng, B. Long-lived protein expression in hydrogel particles: Towards artificial cells. Chemical Science. 9 (18), 4275-4279 (2018).
- Whitfield, C. J., et al. Cell-free genetic devices confer autonomic and adaptive properties to hydrogels. BioRxiv. , (2019).
- Feng, L., Jianpu, T., Jinhui, G. D., Luo, D. Y. Polymeric DNA hydrogel: Design, synthesis and applications. Progress in Polymer Science. 98, 101163 (2019).
- Howard, T., et al. Datasets for Whitfield et al. 2020 Chemical Communications. , (2020).
- Banks, A. M., et al. Key reaction components affect the kinetics and performance robustness of cell-free protein synthesis reactions. Computational and Structural Biotechnology Journal. 20, 218-229 (2022).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli-based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments. (79), e50762 (2013).
- Moore, S. J., et al. EcoFlex: A multifunctional MoClo kit for E. coli synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 5 (10), 1059-1069 (2016).
- Benítez-Mateos, A. I., et al. Micro compartmentalized cell-free protein synthesis in hydrogel µ-channels. ACS Synthetic Biology. 9 (11), 2971-2978 (2020).
