Unik tilgang til isolering af neutrofiler i rotteknoglemarv med sammenlignelig kapacitet

Summary

Denne forskning skitserer to teknikker til isolering af rigelige neutrofile ekstracellulære fælder (NET’er) fra rotteknoglemarv. Den ene metode kombinerer et kommercielt neutrofilisoleringssæt med densitetsgradientcentrifugering, mens den anden kun anvender densitetsgradientcentrifugering. Begge tilgange giver funktionelle NET’er, der overgår dem fra perifere blodneutrofiler.

Abstract

Det primære mål med denne forskning var at udvikle en pålidelig og effektiv tilgang til isolering af neutrofile ekstracellulære fælder (NET’er) fra rotteknoglemarv. Denne indsats opstod på grund af begrænsninger forbundet med den traditionelle metode til ekstraktion af NET’er fra perifert blod, hovedsageligt på grund af manglen på tilgængelige neutrofiler til isolering. Undersøgelsen afslørede to forskellige metoder til opnåelse af rotteneutrofiler fra knoglemarv: en strømlinet ettrinsprocedure, der gav tilfredsstillende rensningsniveauer, og en mere tidskrævende totrinsproces, der udviste forbedret rensningseffektivitet. Det er vigtigt, at begge teknikker gav en betydelig mængde levedygtige neutrofiler, der spænder mellem 50 og 100 millioner pr. Rotte. Denne effektivitet afspejlede resultaterne opnået ved isolering af neutrofiler fra både humane og murinkilder. Signifikant udviste neutrofiler afledt af rotteknoglemarv sammenlignelige evner til at udskille NET’er sammenlignet med neutrofiler opnået fra perifert blod. Den knoglemarvsbaserede metode producerede imidlertid konsekvent betydeligt større mængder af både neutrofiler og NET’er. Denne tilgang demonstrerede potentialet til at opnå betydeligt større mængder af disse cellulære komponenter til yderligere downstream-applikationer. Især disse isolerede NET’er og neutrofiler holder løfte om en række applikationer, der spænder over inflammation, infektion og autoimmune sygdomme.

Introduction

Neutrofiler udgør en kritisk delmængde af leukocytter, der spiller en afgørende rolle i det medfødte immunrespons. De er kendetegnet ved multilobede kerner og granulater indeholdende forskellige proteaser og antimikrobielle peptider¹. Neutrofiler fungerer primært gennem degranulering, fagocytose og dannelse af NET’er. Observationen af NETs blev først foretaget af Takei et al. i 1996 under et eksperiment, hvor neutrofiler blev stimuleret med phorbolmyristatacetat (PMA)². Derefter blev processen med NET-dannelse opfundet “NETosis” af Brinkmann et ^al.3 i 2004. Deres forskning belyste yderligere NETs afgørende rolle i neutrofilmedierede antimikrobielle responser. NETs er weblignende strukturer sammensat af kromatin, histoner og antimikrobielle proteiner, der frigives fra aktiverede neutrofiler som reaktion på infektiøse og inflammatoriske stimuli. NETs kan immobilisere og dræbe invaderende patogener ved at fange dem og udsætte dem for en høj koncentration af antimikrobielle peptider og proteaser ^1,3. Derudover bidrager NETs til clearance af apoptotiske celler og deltager i inflammationsopløsning. Nylige undersøgelser viser også, at overdreven dannelse af NETs eller nedsat netnedbrydning kan føre til vævsskade, autoimmune lidelser, trombogenese og nedsat revaskularisering 4,5,6,7,8,9,10.

NETs patogene rolle i ukontrolleret fibrose efter myokardieinfarkt og dannelsen af ventrikulære aneurismer er blevet påvist gennem udvidelsen af perivaskulær fibrose ^4,11. Myokardieinfarktmodellen og isoleringen af neutrofiler fra knoglemarv hos mus er begge veletablerede. Polymorfonukleære (PMN) leukocytter, en type hvide blodlegemer, der er rigelige i humant blod, tjener som en fremragende kilde til isolering af humane neutrofiler. Denne metode eliminerer behovet for at høste knoglemarv og forbedrer dermed sikkerheden og effektiviteten.

NETs spiller også en rolle i atrieflimren forbundet med hjertemodellering. Imidlertid blev store dyr som hunde og svin brugt til at modellere atrieflimren, da mus mangler et atrium, der er stort nok til at etablere en genoptagelsescyklus eller AF-modellen, medmindre specifikke ionkanaler eller signalveje slås ned eller slås ud¹². Mens det er muligt at inducere atrieflimren hos rotter og isolere neutrofiler fra rotte perifert blod som tidligere beskrevet, stødte forskerne på en begrænsning, hvorved kun 2 x 10^5-5 x 10⁵ neutrofiler kunne isoleres fra perifert blod (10 ml pr. Rotte). Ekstraktion af tilstrækkelige NETs på hvert tidspunkt krævede ca. 10-25 rotter (5 x 10⁶ neutrofiler i alt), hvilket resulterede i en tidskrævende, dyr og ofte lavt udbytte^{proces 13}. I denne henseende præsenterer Li He og kolleger en knoglemarvsorienteret strategi for at opnå tilstrækkelige NET’er fra rotter¹⁴. I deres artikel giver de en omfattende beskrivelse af isolerende neutrofiler fra rotteknoglemarv og sammenligner NET-sekretionsfunktionerne hos rotteperifere og knoglemarvsneutrofiler. De to skitserede metoder imødekommer forskellige eksperimentelle mål, hvilket begge resulterer i tilstrækkelige mængder rotteknoglemarvsneutrofiler, samtidig med at antallet af nødvendige rotter reduceres. To-trins isolationsmetoden viste overlegen neutrofilrensning, mens et-trinsmetoden viste sig tidseffektiv med acceptable rensningsniveauer. Desuden sammenlignede forskerne NETosis og NET-dannelse mellem rotteknoglemarvsneutrofiler og deres perifere modstykker og fandt samme styrke som PMN. Disse resultater bidrager væsentligt til neutrofilrelaterede undersøgelser af atrieflimren og understreger vigtigheden af fleksibelt at vælge forskellige kilder til neutrofilisolering hos forskellige forsøgsdyr med forskellige neutrofilfordelinger.

Protocol

Undersøgelsen blev udført under en projektlicens (nr. 20211404A) udstedt af Animal Ethics Committee of West China Hospital, Sichuan University, i overensstemmelse med retningslinjerne fra Animal Ethics Committee of West China Hospital, Sichuan University for pleje og brug af dyr. I overensstemmelse med etiske retningslinjer blev rotterne anvendt i denne undersøgelse opretholdt i et kontrolleret miljø med en 12 timers lys/mørk cyklus, temperatur på 22-24 °C og fugtighed på 50%-60%. Rotterne fik adgang til mad og v…

Representative Results

Protokollen skitseret heri afgrænser to forskellige metoder, der hver især er kendetegnet ved forbedret rensning eller strømlinede trin. Begge metoder gav ca. 0,5 x 108-1 x 108 neutrofiler pr. rotte. Flowcytometrianalyse, der anvender annexin V-FITC / PI apoptosedetektionssæt, udviste cellelevedygtighed over 90%, sammenlignelig med mus og humane modstykker (figur 1). Mens lymfocytkontaminering syntes uundgåelig under neutrofilisolering fra knoglemarv, viste totrins…

Discussion

Isolering af neutrofiler udgør et afgørende trin i studiet af NETosis, hvor valget af en passende isolationsmetode er afgørende for at opnå pålidelige resultater. En vigtig faktor at veje er forekomsten af lymfocytforurening under isolering. Håndtering af denne udfordring er særlig vigtig, når man isolerer rotteneutrofiler fra knoglemarv. På trods af det særskilte tæthedsområde for neutrofiler (1,0814-1,0919, med en top ved 1,0919) sammenlignet med lymfocytter (1,0337-1,0765, med en top ved 1,0526), forbliver…

Materials

A488-conjugated donkey antirabbit IgG(H + L)	Invitrogen, USA	A32790
A594-conjugated donkey anti-mouse IgG(H + L)	Invitrogen, USA	A32744
A594-conjugated goat anti-Mouse IgG1	Invitrogen, USA	A21125
Anti-rat myeloperoxidase	Abcam, England	ab134132
Anti-rat neutrophil elastase	Abcam, England	ab21595
Celigo Image Cytometer	Nexelom, USA	200-BFFL-5C
DNase I	Sigma, USA	10104159001
fetal bovine serum (FBS)	Gibco, USA	10099141C
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco, USA	C14175500BT
Hoechst	Thermofisher, USA	33342
Isoflurane	RWD, China	R510-22-10
Mowiol	Sigma, USA	81381
Normal Donkey Serum	Solarbio, China	SL050
Paraformaldehyde	biosharp, China	BL539A
Penicillin-streptomycin	Hyclone, USA	SV30010
Percoll	GE, USA	P8370-1L
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Sigma, USA	P1585
Picogreen dsDNA Assay Kit	Invitrogen, USA	P11496
Rat neutrophil isolation kit	Solarbio, China	P9200
Red blood cell lysis buffer	Solarbio, China	R1010
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) media	Hyclone, USA	SH30809.01B
RWD Universal Animal Anesthesia Machine	RWD, China	R500
Sprague Dawley (SD) rats	Dashuo, China
SytoxGreen	Thermofisher, USA	S7020
Tris-EDTA (TE) buffer	Solarbio, China	T1120
Triton-X-100	Biofroxx, German	1139ML100